皮斌/河南省正阳县兽药饲料质量检验监测中心

张三军/河南省驻马店市动物疫病预防控制中心

副猪嗜血杆菌的分离与鉴定

王艳 /河南省驻马店市动物疫病预防控制中心

皮斌/河南省正阳县兽药饲料质量检验监测中心

张三军/河南省驻马店市动物疫病预防控制中心

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，Hps)于1910年由Glasser首次报道，以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为特征，该病又称为革拉氏病(Glasser’S disease)，本菌是常规饲养猪群上呼吸道的一种常在菌，但在特定条件下它可以侵入动物机体并引起严重的全身性疾病，可以影响2月龄～4月龄的猪，常见于4周龄～8周龄，发病率和死亡率均很高，本菌作为猪呼吸道病综合征的主要继发细菌性病原，近年来引起的发病率越来越高，特别是在繁殖呼吸综合征病毒和圆环病毒2型感染后，几乎总是伴随着Hps的感染。副猪嗜血杆菌的血清型在1992年就报道有15种之多，各国各地方流行的血清型也不尽相同，且各型之间缺乏交叉保护，因此，为了了解河南南部Hps的流行状况和血清型分布特点，本试验对豫南某猪场的Hps可疑病料进行了分离和鉴定，从而为下一步研究河南省Hps的血清分型方法、疫苗开发奠定基础。

一、材料与方法

（一）材料

1.试验地点、时间。本试验于2016年3月至2017年9月间在河南省驻马店市动物疫病预防控制中心实验室进行。

2.病料。取Hps可疑病猪的肺脏、心血、胸腹腔积水、心包积液、关节积液。

3.培养基及主要试剂。NAD，购自中国医药(集团)上海化学试剂公司；鲜血培养基和巧克力培养基购于郑州安图绿科生物工程有限公司；麦康凯培养基和普通琼脂培养基为自制；微量生化鉴定试剂购自杭州天和微生物试剂有限公司；药敏纸片购自北京天坛生物科技公司；金黄色葡萄球菌借自河南出入境检验检疫局技术中心微生物实验室。

（二）方法

1.直接涂片镜检。无菌采集病猪的肺脏、心血、胸腹腔积水、心包积液、关节积液直接涂片，干燥固定后分别进行革兰氏染色，镜检。

2.分离培养及培养特性观察。将疑似HPS感染的猪肺脏、关节液分别接种于含NAD的鲜血培养基上，置于体积分数为5%的CO2培养箱中，37℃培养24～48 h后，挑取可疑菌落进行革兰氏染色，镜检。接着将可疑菌落分别接种于麦康凯培养基、普通琼脂培养基、巧克力培养基、普通血平板、含NAD的鲜血培养基上，置于CO2培养箱37℃培养24 h，观察可疑菌株的生长特性。为尽可能排除杂菌干扰，此时可采用格盘法，挑取在巧克力培养基和含NAD的鲜血培养基上生长良好的可疑菌落，在同样的位置分别接种于含NAD的鲜血培养基、巧克力培养基和麦康凯培养基、普通琼脂培养基、普通血平板上，置于体积分数为5%的CO2培养箱中，37℃培养24 h后再次观察分离菌株的生长特性。

3.卫星现象检查。卫星现象检查实验参考 陆承平的兽医微生物学进行的。取两个巧克力培养基的平皿，一个划线接种所分离纯化的细菌并点种金黄色葡萄球菌，另一个只划线接种分离菌做对照。然后于体积分数为5%的CO2培养箱中37℃培养48 h，观察其是否在金黄色葡萄球菌周围长出“卫星现象”。

4.生化试验鉴定。吸取5μl 0.07%过滤除菌的NAD分别无菌加入到脲酶、氧化酶、接触酶、吲哚、葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖和核糖等生化管内，并分别挑取疑似Hps的单个菌落穿刺接种，各接种1管，用石蜡膜封口，放入含体积分数为5%的CO2培养箱中37℃培养3 d后观察。

5.小鼠毒力试验。用已灭菌的注射器吸取1 ml生理盐水，喷洒在可疑菌Hps生长良好的NAD的鲜血培养基上，将可疑菌落洗刮下来制成细菌悬液，分别于腹部皮下接种5只健康成年小白鼠，每只0.2 ml，观察小白鼠的生长情况。

6.药敏试验。药敏试验采用纸片法进行。挑取2～3个可疑菌落划线于含NAD的鲜血培养基上，然后吸取3～5滴生理盐水进行涂布均匀，再把圆形的药敏纸片按一定的比例贴在其上面，置37℃的CO2培养箱中培养48 h，观察结果。

二、结果与分析

1.直接涂片镜检结果

对不同组织部位所取的病料，经直接涂片，革兰氏染色后，在油镜下观察，可见到革兰氏阴性细小杆菌，不形成芽孢，未见鞭毛和荚膜。所查组织中以肺脏和关节液中的细菌最密集。

2.分离培养结果

经过5%CO2培养36 h后，发现在含NAD的鲜血培养基上生长良好，可见到有针尖大小，圆形边缘整齐、灰白色、半明的小菌落生长。挑取这样的小菌落进行染色镜检后可见到革兰阴性的小杆菌。如图1所示，以长而弯曲如长丝状者居多，也有纤细杆状，间有些球杆状，表现出明显的多形性，不形成芽孢，未见荚膜和鞭毛。通过格盘法检查的结果表明，在37℃5%的CO2条件下培养24 h后，在含NAD的鲜血培养基上生长良好，在巧克力培养基上生长稀少，而在麦康凯培养、普通琼脂培养基、普通血平板上不生长。分离培养分离菌的结果符合理论上Hps的培养特性。

图1 分离菌镜检结果（革兰氏染色 1000×）

3.卫星试验结果

卫星试验结果表明，在金黄色葡萄球菌的两侧有针尖大小、圆形、边缘整齐的菌落生长，距金黄色葡萄球菌愈近，菌落愈大，愈远则菌落愈小，呈现出明显的“卫星现象”；而在未接种金黄色葡萄球菌的另一个巧克力平皿上则生长不良，菌落稀少，无“卫星现象”出现。

4.生化试验结果

挑取可疑菌落，接种加入了NAD的生化管中，生化试验结果见表1。

表1 分离菌生化试验结果

由表1可知，分离菌发酵葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖，不发酵核糖；氧化酶、尿酶、吲哚试验结果为阴性，接触酶为阳性。该分离菌的生化试验结果基本和理论上Hps的相一致，说明该分离菌为Hps。

5.小鼠毒力试验结果

分离菌接种小白鼠后，16～36 h内小白鼠全部死亡，分别无菌取小白鼠的心血、肝、肺、气管病料接种于NAD的鲜血培养基上，37℃5%CO2条件下培养48 h，在肺、气管接种的NAD鲜血培养基上分离到疑似的副猪嗜血杆菌菌落，涂片镜检出现和患病猪体内相似的革兰氏阴性细小杆菌。

6.药敏试验结果

药敏试验结果见表2。

根据中华人民共和国卫生行业标准，纸片法抗菌药物敏感试验标准（Kirby-Bauer Method），对药敏试验结果进行判断，Kirby-Bauer Method未建议使用的药物，仅报告其抑菌圈直径，不做敏感性分析。从表2可看出，分离菌株对环丙沙星、头孢他啶、头孢噻唑、庆大霉素均敏感，对林克霉素、土霉素、四环素均耐药，而对恩诺沙星为中度敏感型药物。对诺氟沙星不做敏感分析。通过药敏试验，可根据敏感的药物对相应发病猪场进行药物治疗，临床用药应在药敏试验结果指导下进行。

表2 分离菌药敏试验结果

三、讨论

1.Hps的发病原因及预防要点

副猪嗜血杆菌通常只感染猪，可以影响2周龄～4月龄的青年猪，主要在断奶后和保育阶段发病，常见于5～8周龄的猪，发病率一般在10%～15%，严重时病死率可达50%。但我国对Hps的研究还不够系统深入，重视程度不够。该病多发于春冬气候骤变季节，长途运输、饲料更替、断奶、饲养密度过大、圈舍潮湿等应激因素是其主要诱因。因此宜对该病采取综合防治措施：加强饲养管理，尽量减少各种应激，实行全进全出制度，防止不同年龄的猪只混养等。目前疫苗免疫是预防Hps最有效的方法之一，在一些地方应用自家苗预防Hps感染，也取得了很好效果。副猪嗜血杆菌的临床症状、剖检病变和流行病学特征与猪的链球菌病、支原体肺炎、传染性胸膜肺炎等有相似之处，临床上很容易将它们混淆。在诊断时应从流行特点、临床症状、病理变化和实验室检查等多方面来综合分析，以降低该病对养猪业造成的危害。

2.副猪嗜血杆菌难分离的原因及解决办法

本试验针对河南某个猪场疑似副猪嗜血杆菌感染病例进行了病原的分离和鉴定，并对分离株进行药敏试验，以便为猪场副猪嗜血杆菌病的控制起到一定的指导作用。副猪嗜血杆菌在病料中的分离率比较低，一般患病猪死亡12 h后，在病料中几乎分离不到，因此需在患猪剖杀或死亡后12 h以内及时进行病原分离。而且副猪嗜血杆菌十分娇嫩，对营养要求苛刻，其在巧克力培养基上培养36h～48h生长较差，由于副猪嗜血杆菌有较高的培养要求，其生化实验的关键是特殊培养基基质的选择，或者商品生化反应管的营养改良。血清、NAD等成份的加入可以保证副猪嗜血杆菌的培养成功，但是必须保证加入的成份不改变生化试剂的pH值等生化特性。一般病原分离应采用含NAD的营养丰富的鲜血平板培养基。本试验在鲜血平板上加入了30μl0.07%的NAD因子，不但没有改变培养基的理化特性，而且使得可疑菌生长良好，而在未加NAD因子的鲜血培养基上可疑菌不生长，而且该分离菌在巧克力培养基上也很少生长，对培养基的改良显得十分重要。此外，目前各猪场在实际生产中广泛使用抗生素，也是副猪嗜血杆菌分离较低的原因之一，因此在日常的疾病预防和诊治时，不要盲目用药，要在药敏试验结果的指导下进行用药。另外副猪嗜血杆菌是猪上呼吸道中的一种常在菌，故评定疾病是否由副猪嗜血杆菌感染引起，最好能从浆膜、心包、腹膜、关节和脑膜等全身各部位采样送检，才能进行本菌感染的诊断。

3.对Hps研究的必要性及意义

由于副猪嗜血杆菌存在多个血清型，不同菌株对同一种抗生素的敏感性有很大差异，在药敏试验中，可根据高度敏感的药物对相应发病猪场进行药物治疗，临床用药应在分离菌株的药敏试验结果指导下进行。血清型的多样性以及占很大比例的不能分型菌株，也影响了对具有高效交叉保护力疫苗的研制。副猪嗜血杆菌是早期定居菌，血清型有15种之多，其致病力与血清型有关，这就难以通过管理措施来控制其引起的疾病。本试验通过对副猪嗜血杆菌的相关研究，通过形态学观察、病原菌分离培养、生化鉴定、动物试验，分离和鉴定出了副猪嗜血杆菌。详细说明了副猪嗜血杆菌的特性，为进一步研究副猪嗜血杆菌的抗原特性，疫苗研制、临床预防、诊断等奠定了基础，也为下一步确定副猪嗜血杆菌的血清型提供了实验依据。在我国，由于饲养技术的调整进行不当，以及突发的新的呼吸道综合征，使得该病日趋流行，危害日渐严重。近年来，我国各猪场发生多发性浆膜炎和关节炎的报道屡见不鲜，其中不少病例的病原被初步诊断为副猪嗜血杆菌，但限于试验条件，很少有人对其进行确切诊断。因此对我国的副猪嗜血杆菌病的流行病学进行调查并确定我国流行的主要血清型已成为时势所趋。

（略）