冯 暄，孟照琰，闫有圣，郝胜菊，张庆华，陈 雪，梁济慈

(1.甘肃省妇幼保健院产科；2.医学遗传中心，甘肃 兰州 730050)

特殊特纳综合征1例孕妇的遗传学分析

冯 暄2，孟照琰1，闫有圣2，郝胜菊2，张庆华2，陈 雪2，梁济慈2

(1.甘肃省妇幼保健院产科；2.医学遗传中心，甘肃 兰州 730050)

目的通过1例特殊特纳综合征孕妇的多种遗传学检测分析，探讨特纳综合征的临床表型及遗传学特点，为该类遗传咨询和临床治疗提供依据。方法对1例无创DNA产前检测技术(NIPT)检测X染色体异常的孕妇进行遗传学分析，羊水穿刺采用羊水细胞培养及染色体制备技术及荧光原位杂交(FISH)技术分析胎儿染色体；采用染色体核型分析技术及荧光原位杂交技术分析孕妇外周血及口腔脱落细胞。结果NIPT检测结果显示母体X染色体有缺失；经羊水核型分析，胎儿染色体正常；孕妇外周血染色体核型结果：45，XO；孕妇口腔黏膜脱落细胞FISH结果：47，XXX(65%)/45，XO(23%)/46，XX(12%)。结论将细胞遗传学、分子遗传学以及分子细胞遗传学技术结合使用后能够有效提升特纳综合征诊查的准确性，精准的诊断能够为患有该症患者的遗传咨询以及临床诊治提供参考依据。

特纳综合征；高通量测序技术；口腔黏膜脱落细胞；无创基因产前检测

特纳综合征又称先天性卵巢发育不全，属于一种比较多见的性染色体疾病，占据女性新生儿的1/5 000，在染色体异常中的发病率比较高[1]。该综合征一般均具备以下几点特征，即女性表型、原发性闭经、身体发育迟缓、第二性征发育不明显等，与此同时也会产生发际低以及头面部多色素痣等多种症状。其染色体核型一般均为45，X，其中可包含以45，X核型为主体共同存在的46，X，i(Xq)、46，X，i(Xp)以及46，X，r(X)等多种类型的Turner综合征嵌合体核型[2]。本文对甘肃省妇幼保健院1例特殊的特纳综合征患者进行遗传学分析。

1病例资料

1.1资料

孕妇：31岁，孕13周，G1P0，单胎妊娠，自然受孕。患者16岁月经初潮，周期规则，非近亲结婚。体格检查：外貌健康，身高1.47米，智力正常，无特纳综合征体征，乳房、外阴发育正常，内分泌激素水平正常，子宫及附件正常。因无创DNA产前检测技术(non-invasive prenatal，NIPT)筛查结果提示母亲X染色体有缺失，抽取孕妇羊水及孕妇外周血，通过不同的遗传学检测方法对此病例进行确诊。

1.2方法

1.2.1无创DNA产前检测技术

用streck采血管采集孕妇外周血10mL，用两步离心法将分离好的血浆用磁珠法进行血浆游离DNA的提取。提取获得的DNA采用Invitrogen Qubit核酸定量计检测血浆游离DNA浓度。采用高通量测序文库构建试剂盒完成NIPT文库构建，主要步骤包括：DNA末端修复，通用测序引物及样本识别标签(Barcodes)连接，文库构建产物纯化。构建完成的文库采用KAPA SYBR FAST qPCR 试剂盒对文库进行准确定量。构建成功的文库根据每个样本文库的浓度进行混合(Pooling)，将混合的文库在NextSeq CN 500高通量测序仪平台上进行大规模并行测序(massively parallel sequencing，MPS)，测序数据进行生物信息学分析，计算出每条染色体的Z值。以Z值=3为切割值，当13、18或21号染色体其中之一的Z值gt;3时，提示胎儿存在该染色体三体综合征高风险。

1.2.2羊水及外周血染色体核型分析

此样本NIPT结果提示该孕妇性染色体异常，通知孕妇进行遗传咨询并告知相关风险，该患者同意进行产前诊断并签订知情同意书，羊膜腔穿刺术在甘肃省妇幼保健院产前诊断中心B超引导下进行。羊水样本送至医学遗传中心细胞遗传实验室，依照规范化的操作要求与流程进行细胞培养。

常规采集孕妇的外周血样本，肝素抗凝，使用普通的中期染色体标本制片方式准备染色体以及G显带。当显带处于350～500G状态时，使用Zeiss全自动染色体核型分析设备以及metafer4分析软件对其染色体实行采集与探究。

1.2.3口腔黏膜脱落细胞标本采集及处理

选择应用无菌棉签收集两侧的颊黏膜拭子，将其放置在干燥且无菌的离心管中。在此过程中，应收集规格含量为2mL的肝素钠抗凝静脉血进行检验。具体方法参考文献[3]，通过对标本进行消化、低渗以及固定处理滴片之后，对其采取荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)检测。

1.2.4荧光原位杂交检测

选择应用FISH探针(由金菩嘉企业所生产的试剂盒)。FISH检测步骤：①样本玻片制备；②玻片预处理；③变性杂交；④玻片洗涤；⑤复染；⑥结果分析及评定。无规律性选择100个羊水细胞进行计数处理，且判断要求主要包括以下几点，即：超过90%符合常规的细胞呈现正常状态；超出60%出现异常的细胞呈现异常状态；处于15%～60%这一范围或者超过60%的细胞呈现异常状态，计数增加到200个细胞，判定嵌合体信号形式。

1.2.5多重探针连接依赖式扩增

实验采用多重探针连接依赖式扩增(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)非整倍体检测试剂盒(SALSA MLPA P095，荷兰MRC公司) ，该试剂盒包括36条探针，其中13、18、21 和X染色体上分别有8条，另4条位于Y染色体，实验经过DNA的变性、探针杂交、连接反应、扩增、及产物分析可检测这5种染色体拷贝数的变化。

2结果

NIPT结果提示：该样本X染色体有缺失，而这个异常大多考虑来自于母体。孕妇经遗传咨询，同意行羊水穿刺，对胎儿的结果进行确诊，并同时抽取外周血，进行染色体核型分析。将抽取得羊水同时进行羊水细胞培养，核型分析以及多重连接探针扩增技术进行检测，胎儿染色体结果：46，XY(见图1、图2)。孕妇外周血核型分析结果：45，XO(见图3)。由于非嵌合型特纳患者生育正常胎儿十分罕见，为避免孕妇为低比例嵌合，我们又对孕妇外周血进行了FISH检测。结果依然显示为：45，XO(见图4)。加大细胞计数后，结果同样为45，XO。为了确定这一结果，我们又将孕妇召回，对其口腔黏膜细胞进行FISH检测，结果显示：该样本为47，XXX(65%)/45，XO(23%)/46，XX(12%)的嵌合体(见图5)。

图1胎儿羊水染色体G显带核型：46，XY

Fig. 1 Karyotype of G-banding of fetal amniotic fluid chromosome: 46,XY

图2胎儿羊水MLPA结果

Fig.2 MLPA result of fetal amniotic fluid

图3孕妇外周血染色体G显带核型：45，XO

Fig.3 Karyotype of G-banding of maternal peripheral blood: 45, XO

图4孕妇外周血FISH结果：45，XO

Fig.4 FISH results of maternal peripheral blood: 45, XO

图5孕妇口腔黏膜FISH结果：47，XXX/45，XO/46，XX

Fig.5 FISH results of maternal mouth desquamated cell: 47, XXX/45, XO/46, XX

3讨论

3.1特纳综合征的遗传学分析

特纳综合征也可以称为先天性卵巢发育不全，此种疾病的主要原因为所有或者少量体细胞中1条X染色体完全缺失或者部分缺失。在人类的众多单体综合征中，属于唯一可以生存的一种，其在性染色体疾病中比较常见，并且在女性的发病率中大约占据1/2 500[4]。

在普通女性的体细胞中一般均具备两条X染色体，且卵巢发育功能的体现均源自于这两条X染色体。如果X染色体数量或结构体系出现异常状态时，会对女性性腺发育产生严重的不良影响，进而产生与其相对的临床症状。通常情况下其核型可包括以下几种类型，即：X单体、嵌合体、结构异常体积含Y等，患有此种疾病的患者即使有着相似的表型，但是各种核型的差异性导致个体之间的表型仍有很多不同之处，虽然核型相同也能够呈现出较大的差异性，产生此种情况的主要原因为遗传性疾病特殊症状体征的体现是在环境因素的影响下所产生的，属于遗传底物的结果产物，即便是相同的核型与基因型，但是在环境因素以及基因外显率等多个方面的作用下，导致患者表型也会呈现出变异反应[5]。

特纳综合征属于一类由X染色体缺失或者结构异常而引起的染色体异常性病症。正常女性有2条X染色体，但Turner综合征患者其中的1条X染色体出了问题。一类是临床中最常见的X染色体缺失(即核型45，X，约占50%)，45，X 是常见的核型，主要是由于亲代之一生殖细胞的性染色体在减数分裂Ⅰ期时不分离所致，单一的X 染色体2/3来自于母亲[6]，这些患者体内的细胞仅含有一条X染色体。还有一类患者属于嵌合型，意思是人体内有一部分细胞是X染色体缺失，而另一部分细胞染色体是正常的。嵌合体形成的原因可能是由于受精卵卵裂时有丝分裂后期染色单体迟留，导致了X染色体的随机丢失。对于携带有45，X/46，XX 嵌合患者而言，正常细胞系比例越大，患者的临床症状就越轻[7]。另外还有一部分患者的X染色体数目正常，但结构发生了改变。根据染色体病变的程度不同，患者发生第二性征不发育及不孕的表现也是轻重不一的。据统计20%～30%患者可以和正常同龄人一样青春发育，2%可月经来潮，1.8%～7.6%可以自然生育，但其中仅有30%～40%的人可以生出健康的宝宝[8]。

本病例孕妇身高1.47米，体重56公斤。智力及生殖系统正常，女性第二性征正常，月经初潮年龄为15岁，月经周期25～28天，经期6～7天。因无创产筛提示性染色体异常才发现孕妇性染色体异常。大约2%的特纳综合征的成年女性可有自然怀孕，此种情况原因有二：其一即为嵌合型特纳综合征，所表示的是部分细胞的染色体体现为常规的23对46条，少量细胞的染色体只有45条，缺失了一条X染色体，并且假设常规细胞的比重较高，性腺功能不足的表现越轻；其二是染色体数目虽然正常，但染色体结构有异常，碰巧的是控制卵巢功能的基因(在Xq13-q26区域)尚且还是正常的，因此保留了卵巢的功能。此孕妇进行了外周血核型分析和FISH检测后均显示核型为45，XO，胎儿羊水行核型分析及MLPA技术检测均显示正常。

3.2特纳综合征的遗传效应

在传统化的细胞遗传学中，一般情况下均选用患者外周血实行淋巴细胞染色体分析，大多时候进行分析的核型能够对性染色体异常患者做出诊断。口腔黏膜细胞应用便捷，患者容易接受，培养方式与制片水平相对完善，临床上均被用来对外周血不同胚层来源组织进行遗传学分析。

由于非嵌合型的特纳综合征患者能够生育正常胎儿是极其罕见的，为此我们又将孕妇召回，对她的口腔黏膜脱落细胞进行了FISH检测。口腔黏膜上皮属于复层鳞状上皮，并有着代谢旺盛、更新速度快及容易脱落的特征。其是由多层细胞构成，基底层分裂旺盛，表层部分的角化层逐渐衰退、脱落。此种细胞源自于胚胎外胚层细胞，和机体组织细胞进行对比后可发现，二者之间有着同样的遗传物质，结果显示此孕妇是一个嵌合型的特纳综合征患者。依此推测，口腔黏膜发育的胚层可能与卵巢发育的胚层来源相似。这也更一步证实了Bisat等[9]的研究，口腔黏膜脱落细胞更能反映生殖腺嵌合的状况。最终还要确定这例孕妇卵巢嵌合比例的结果，还需要做进一步的卵巢组织活检。

综上所述，在出生时被诊查为特纳综合征的大约占15%，少年时被诊查为特纳综合征的大约占26%，成年之后被诊查为特纳综合征的大约占据38%，其他均诊查于儿童时期。此种疾病的诊断主要源自于染色体核型分析，当对其进行分析的过程中，遇嵌合体众数分析时应当增加计数，避免出现漏诊的情况。也可以对口腔黏膜脱落细胞进行染色体检验，并充分掌握性腺核型嵌合状况。

[1]李艳娟,王凤荣.特纳综合征合并冠心病1例报告并文献复习[J].中国实用内科杂志,2014,34(4):403-405.

[2]Reindollar R H.Turner syndrome: contemporary thoughts and reproductive issues[J].Semin Reprod Med,2011,29(4):342-352.

[3]Nieuwint A W,Van Hagen J M,Heins Y M,etal.Rapid detection of microdeletions using fluorescence in situ hybridisation (FISH) on buccal smears[J].J Med Genet,2000,37(6):E4.

[4]刘楠.Turner综合征sSMC的特点、来源及鉴定方法研究进展[J].中国优生与遗传杂志,2015,23(5):7-8,26.

[5]Rao E,Weiss B,Fukami M,etal.Pseudoautosomal deletions encompassing a novel homeobox gene cause growth failure in idiopathic short stature and Turner syndrome[J].Nat Genet,1997,16(1): 54-63.

[6]Saenger P,Bondy C.Turner syndrome: strategies to improve care outcomes. Foreword[J].Pediatr Endocrinol Rev,2012,9 (Suppl 2):696-697.

[7]欧阳鲁平,黄红倩,谢意,等.34例特纳综合征羊水染色体核型分析与临床诊断[J].中国优生与遗传杂志,2015,23(1):39-40,56.

[8]Liu X Y,Zhang H G,Chen S,etal.45,X mosaicism in northeast China: a clinical report and review of the literature[J].J Assist Reprod Genet,2013,30(3):407-412.

[9]Bisat T,May K,Litwer S,etal.Y chromosome mosaicism in the gonads, but not in the blood, of a girl with the Turner phenotype and virilized external genitalia[J].Clin Genet,1993,44(3):142-145.

[专业责任编辑：游 川]

GeneticanalysisofapregnantwomanwithspecialTurner’ssyndrome

FENG Xuan2, MENG Zhao-yan1, YAN You-sheng2, HAO Sheng-ju2, ZHANG Qing-hua2, CHEN Xue2, LIANG Ji-ci2

(1.DepartmentofObstetrics; 2.MedicalHeredityResearchCenter,GansuMaternalandChildHealthCareHospital,GansuLanzhou730050,China)

ObjectiveTo explore clinical manifestation and genetic characterisitcs of Turner's syndrome through various genetic testing and analysis of a pregnant woman with special Turner’s syndrome, so as to provide basis for consultation and treatment of such genetic disease.MethodsGenetic analysis was carried out on a pregnant woman with X chromosome abnormality detected by non-invasive prenatal test (NIPT). Fetal chromosomal analysis was implemented by culture of amniotic cell collected through amniocentesis, chromosome preparation and fluorescence in situ hybridization (FISH). Maternal peripheral blood and mouth desquamated cells were analyzed by karyotype analysis and FISH analysis.ResultsNIPT results showed deletion in maternal X chromosome. Karyotype analysis of amniotic cell showed that fetal chromosome was normal. Maternal peripheral blood karyotyping result was 45, XO. Maternal mouth desquamated cell FISH result was 47, XXX (65%)/45, XO (23%)/46XX (12%).ConclusionCombination of cytogenetics, molecular genetics and molecular cytogenetic technology can effectively improve the diagnostic accuracy of Turner’s syndrome, and accurate diagnosis provides reference for genetic counseling and clinical treatment of this disease.

Turner’s syndrome; high throughput sequencing; mouth desquamated cell; non-invasive prenatal test (NIPT)

10.3969/j.issn.1673-5293.2017.11.044

R711.7

A

1673-5293(2017)11-1446-04

2017-02-09

冯 暄(1983—)，女，助理研究员，硕士，主要从事医学遗传学的研究。

孟照琰，副主任医师。