丁桂春，李冰心，刘 倩，张玲玲

(扬州市妇幼保健院 扬州大学医学院附属医院妇产科，江苏 扬州 225000)

循环miRNA-210的表达与胎儿生长受限的相关性分析

丁桂春，李冰心，刘 倩，张玲玲

(扬州市妇幼保健院 扬州大学医学院附属医院妇产科，江苏 扬州 225000)

目的分析miRNA-210与胎儿生长受限的相关性，阐明循环中miRNA-210在胎儿生长受限发病机制中的作用，为胎儿生长受限的早期诊断及病理机制提供新的生物学标志物。方法选择2015年1月至2016年1月在扬州市妇幼保健院分娩的产妇，采取随机原则，选取符合胎儿生长受限孕足月分娩(包括顺产及剖宫产)的30例孕妇为胎儿生长受限组，选取同期足月分娩正常体重新生儿的孕妇30例为对照组，采集两组孕妇外周血，提取RNA采用Trizol法，Real Time-PCR分别测定胎儿生长受限组和对照组循环中miRNA-210的表达水平与选择内参基因U6表达的相对值，分析miRNA-210与胎儿生长受限的相关性。结果胎儿生长受限组与对照组产妇年龄、孕前体重、孕周比较无明显差异(t值分别为0.84、0.74、0.48，均Pgt;0.05)，但胎儿生长受限组新生儿体重明显低于对照组，差异有统计学意义(t=8.56，Plt;0.01)。胎儿生长受限组miRNA-210的表达水平为4.58，与对照组相比，表达明显增加(t=7.43，Plt;0.01)。miRNA-210可作为一个潜在的生物学标志物来区分胎儿生长受限及正常发育儿。结论胎儿生长受限组循环中miRNA-210的表达水平明显升高，miRNA-210可能参与了胎儿生长受限的发病，循环中miRNA-210可作为胎儿生长受限诊断的生物标志物。

胎儿生长受限；循环；生物标志物；miRNA-210

胎儿生长受限(fetal growth restriction，FGR)是足月胎儿出生体重小于2 500g或胎儿体重低于同孕龄平均体重的两个标准差，或低于同孕龄正常体重的第10百分位数[1-2]。胎儿生长受限对围生儿在近期及远期都可能造成不可逆转的不良影响，是产科常见的、严重的并发症之一，导致围生儿患病率增高，是围生儿死亡的主要原因之一[3]。胎儿生长受限的病因多且复杂，迄今其病因尚不明确，且胎儿生长受限早期诊断困难。目前产科的研究热点之一是胎儿生长受限的早期诊断及其发病机制的研究。

miRNA是一类非编码单链小RNA，参与多种疾病过程，研究表明可通过检测患者外周血浆中miRNA来进行疾病的诊断[4-5]。近年来发现循环miRNA可作为诊断妊娠性疾病的潜在生物标记物[6]。目前miRNA与胎儿生长受限的研究仅限于少数miRNA，且缺乏血浆中miRNA表达谱的发现。本研究发现循环中miRNA-210的差异表达与胎儿生长受限相关，通过探讨循环中miRNA-210与胎儿生长受限的相关性，从而阐明miRNA-210在胎儿生长受限中的作用，对胎儿生长受限的发病机制、病因研究及早期诊断有重要意义。

1对象与方法

1.1研究对象

选择2015年1月至2016年1月在扬州市妇幼保健院分娩的产妇，采取随机原则，选取符合胎儿生长受限孕足月分娩(包括顺产及剖宫产)的30例孕妇为胎儿生长受限组，选取同期足月分娩正常体重新生儿的孕妇30例为对照组。所有研究对象既往无特殊病史。胎儿生长受限纳入标准参考第8版《妇产科学》：①足月胎儿出生体重小于2 500g；②胎儿出生体重低于同孕龄平均体重的两个标准差或低于同孕龄正常体重的第10百分位数[2]。

1.2方法

1.2.1标本收集

收集胎儿生长受限组及对照组产妇外周抗凝血5mL，室温下1 200r/min离心10min，分离的血浆样本于-80℃保存待测。采集标本前的器具进行防RNA酶污染处理。

1.2.2检测循环中miRNA-210的相对表达量

采用实时荧光定量聚合酶链式反应(poly-merasechainreaction，PCR)检测循环中miRNA-210的相对表达量。

1.2.2.1抽提血浆中的RNA 每200μL血浆加入5倍体积Trizol，剧烈震荡30s，室温放置5min。按Trizol法提取各个血浆中的RNA(使用miRNeasy Mini Kit试剂盒)，按说明书操作。提取的RNA先用分光光度计定量，随后用凝胶电泳试验质检RNA的质量是否合格。

1.2.2.2逆转录 将下述各种反应物加入八联管后轻柔混匀，在冰上放置5min，再放入PCR仪进行逆转录，反应条件：16℃ 30min，42℃ 30min，85℃ 5min，4℃ 5min。逆转录产物加入5μL去核糖核酸酶水，使其终体积为20μL。逆转录合成cDNA，于-20℃保存。逆转录体系如表1所示：

表1 逆转录体系

1.2.2.3实时荧光定量聚合酶链反应 将反应体系配制成5μL，加在96孔板中，混匀后进行定量聚合酶链反应。实时荧光定量聚合酶链反应的反应条件：50℃ 2min，95℃ 10min，95℃ 15s，60℃ 1min进行40个循环。 所有样本均做3次重复，反应体系配制如表2所示。

表2 聚合酶链反应体系

1.2.2.4 PCR反应引物 所用引物由试剂公司设计合成。采用U6 RNA作为内参照，见表3。

表3 引物序列

1.2.2.5定量聚合酶链反应结果分析 用溶解曲线分析PCR产物的单一性，是否具有引物二聚体的存在。采用SDS 2.3软件对数据进行分析。用U6作为内参对照基因，用公式2-△△CT计算miRNA-210的相对表达量。miRNA-210的相对含量=2-△△CT。

△△CT=(CtmiRNA-210-CtU6)胎儿生长受限组-(CtmiRNA-210-CtU6)对照组

1.3统计学方法

2结果

2.1研究对象的基本资料

胎儿生长受限组与对照组孕产妇年龄、孕期体重、孕周比较无明显差异(Pgt;0.05)，但胎儿生长受限组新生儿体重明显低于对照组，差异有统计学意义(t=8.56，Plt;0.01)，见表4。

表4 两组一般临床资料的比较

2.2循环中miRNA-210的表达水平比较

本研究采用实时定量聚合酶链反应法检测循环中miRNA-210表达水平。结果显示，胎儿生长受限组miRNA-210的表达水平为4.58，与对照组相比，表达明显增加(t=7.43，Plt;0.01)，见图1。

图1 FGR组与对照组循环中miRNA-210表达水平

Fig.1 Expression level of miRNA-210 in FGR group and control group

2.3通过miRNA-210的表达构建ROC曲线

ROC曲线的构建，设定对照组循环中miRNA-210表达的95%参考区间为风险值，通过计算ROC曲线下面积(AUC)来划分对照组与胎儿生长受限组的灵敏度和特异度。miRNA-210可作为诊断胎儿生长受限的一个潜在生物学标志物，其AUC为0.708，灵敏度为88.20%，特异度为67.80%，见图2。

图2 miRNA-210划分对照组与胎儿生长受限组的ROC曲线图

Fig.2 ROC curves of miRNA-210 dividing control group and FGR group

3讨论

3.1 miRNA与妊娠相关疾病的关系

有研究表明miRNA参与各种疾病如乳腺癌[7]，子痫前期[8]等的发病。也有研究表明miRNA在细胞分化、增殖和凋亡、胰岛素分泌[9]、心脏病发生[10]、胚胎发育[11]等过程中发挥重要作用。miRNA-210在子痫前期胎盘滋养细胞上表达丰富，调控细胞分化、增殖，线粒体呼吸等[12]，在缺氧状态下，miRNA-210的表达是上升的，表明miRNA-210参与妊娠期相关疾病的发病。研究表明妊娠早期可使用循环中C19MC筛查孕妇子痫前期的发病风险[13]。循环中有些miRNA可作为妊娠相关疾病的潜在生物标志物[14]。

3.2 miRNA-210在胎儿生长受限中的表达

目前国内外未见循环血miRNA-210参与胎儿生长受限发病机制的研究，我们选择miRNA-210作为本课题的研究目标。本研究采用实时RCR方法分别检测了胎儿生长受限组和对照组孕妇循环血中miRNA-210的表达水平，发现在胎儿生长受限组孕妇循环血中miRNA-210高表达，这与近期的国外报道一致[15]。本研究发现胎儿生长受限组孕妇循环血中miRNA-210的表达水平明显高于对照组孕妇循环血，提示miRNA-210在胎儿生长受限中表达明显升高，可能参与了胎儿生长受限的发生、发展。

目前的研究还不完善，本研究仅仅检测了miRNA-210在胎儿生长受限孕妇循环血中呈明显高表达，但miRNA-210如何参与胎儿生长受限的机制尚不明确，将进一步进行研究。通过miRNA-210的表达水平可以很好的区分胎儿生长受限组和对照组。因此，循环血中miRNA-210有可能成为一个较好的标志物应用于胎儿生长受限的临床诊断。

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[专业责任编辑：于学文]

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CorrelationanalysisofcirculatingmiRNA-210expressionlevelwithfetalgrowthrestriction

DING Gui-chun， LI Bing-xin, LIU Qian，ZHANG Ling-ling,

(GynecologyandObstetricsDepartment,YangzhouMaternalandChildHealthHospital,AffiliatedwithYangzhouMedicalUniversity,JiangsuYangzhou225000,China)

ObjectiveTo study the relationship between miRNA-210 and fetal growth restriction (FGR) and clarify the effect of circulating miRNA-210 in the pathogenesis of FGR, so as to provide new biomolecular maker for early diagnosis and pathogenesis of FGR.MethodsFrom January 2015 to January 2016 random principle was adopted to select 30 prenant women delivering full-term neonates with FGR in FGR group and 30 cases of normal controls in control group. RNA was extracted and Trizol reagent and Real Time-PCR were used to determine circulating miRNA-210 expression level and relative value of reference gene U6 to analyze the correlation of miRNA-210 with FGR.ResultsThere was no obvious difference between FGR group and normal control group in maternal age, pre-pregnancy weight and gestational age (tvalue was 0.84，0.74 and 0.48, respectively, allPgt;0.05), but neonatal weight of FGR group was remarkably lower than that of the control group with statistical difference (t=8.56,Plt;0.01). The level of circulating miRNA-210 was 4.58 in FGR group, which increased significantly compared to the control group (t=7.43，Plt;0.01). MiRNA-210 might be used as a potential biological marker to distinguish neonates with FGR from normal ones.ConclusionThe expression level of miRNA-210 is significantly increased in FGR group, and miRNA-210 may be involved in the pathogenesis of FGR. Circulating miRNA-210 can be used as biomarker in early diagnosis of FGR.

fetal growth restriction (FGR); circulation; biomarker; miRNA-210

10.3969/j.issn.1673-5293.2017.11.003

R714.5

A

1673-5293(2017)11-1325-03

2017-06-20

扬州市科技计划项目(YZ2014214)

丁桂春(1982—)，女，主治医师，硕士，主要从事妊娠期高血压及胎儿生长受限的研究。

张玲玲，副主任医师。