张治平，戴海博，耿园

（扬州大学园艺与植物保护学院，江苏，225009）

叶面喷施不同浓度ALA对黄瓜幼苗抗氧化酶系统的影响

张治平，戴海博，耿园

（扬州大学园艺与植物保护学院，江苏，225009）

为了探讨叶面喷施5-氨基乙酰丙酸（ALA）在黄瓜苗期的施用浓度和效果，以黄瓜品种津春4号3叶1心期的幼苗为材料，研究了不同浓度ALA对黄瓜幼苗叶片光合色素含量和抗氧化酶系统的影响。试验结果表明，叶面喷施10、30、50 mg/L的ALA可明显提高黄瓜叶片叶绿素（Chl）和类胡萝卜素（Car）含量，降低Chl a/b比值；显著增加超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）和过氧化物酶（POD）活性，脯氨酸和可溶性蛋白含量；降低超氧阴离子（O2-·）生成速率、过氧化氢（H2O2）和丙二醛（MDA）含量；当ALA浓度达100 mg/L时，黄瓜幼苗受到一定的氧化胁迫伤害。这些结果说明，喷施浓度不超过100 mg/L ALA可促进黄瓜幼苗叶片光合色素的合成、增加其抗氧化能力，降低膜脂过氧化的程度，综合各项指标，以30 mg/L的ALA叶面喷施浓度在黄瓜幼苗上效果最佳。

黄瓜；5-氨基乙酰丙酸（ALA）；叶绿素；抗氧化酶；氧化胁迫

5-氨基乙酰丙酸（ALA）是所有生物体内卟啉化合物（包括叶绿素、亚铁血红素、光敏素等）生成合成的第一个关键前体，与植物的光合作用、呼吸作用等有着密切关系，能够调节植物的生长发育，促进作物的产量，提高植物的抗逆性[1～3]。然而ALA在黄瓜上的作用效果和施用浓度，目前存在着很大的差异。刘玉梅等[2]认为0.5 mg/L ALA喷洒幼苗可以提高黄瓜品种津优1号叶片净光合速率（Pn）和光化学效率，提高黄瓜幼苗亚适宜温光环境的光合适应性。Zhen等[3]则认为50 mg/L ALA缓解盐胁迫对津春2号黄瓜造成的伤害最明显。Tripathy等[4]研究表明，喷施20 mmol/L ALA能够造成黄瓜的光合电子传递链的光动力损伤。为了确定叶面喷施ALA在黄瓜幼苗期的最佳施用浓度和应用效果，本试验以黄瓜（Cucumis sativusL.）品种津春4号为材料，研究叶面喷施不同浓度ALA对黄瓜幼苗叶片叶绿素含量、抗氧化酶活性、脯氨酸和可溶性蛋白的含量、以及O2-·生成速率和MDA含量的影响，皆在探讨ALA在黄瓜应用上的浓度效应，以期为ALA在黄瓜生产上的推广应用提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料培养

本试验以黄瓜品种津春4号为材料。挑选饱满的种子用50℃温水浸种灭菌10 min，30℃恒温箱中催芽2 d，种子露白时，播种于装有育苗专用基质（镇江兴农有机肥有限公司）的10 cm×10 cm（高度×口径）黑色营养钵中，放入步入式植物生长箱（GBC-1600K型培养箱，宁波江南仪器厂）内，培养条件设定温度为（25±1）℃/（18±1）℃（昼/夜），光周期为12 h/12 h（昼/夜），最大光照强度为10万lx，育苗期间每天上午8：00浇透水。

1.2 材料处理

黄瓜幼苗培养至3叶1心期，选取生长一致的植株，用10、30、50、100 mg/L的ALA（粉剂，购于Sigma公司）溶液喷施，并设清水（0 mg/L ALA）对照。喷施时溶液中添加0.01%Triton，均匀的喷洒叶片的正反面，以叶片滴水为喷施标准。每个处理重复3次，每个重复20棵植株。ALA处理后第4天，取第2片真叶测定相关指标。

1.3 试验方法

①叶片光合色素的含量测定采用参照Lichtenthaler[5]的方法，将黄瓜叶片剪碎放入小试管中，用95%乙醇提取液黑暗中静置提取24 h，测定470、649、665 nm的OD值，并计算叶绿素a（Chl a）、叶绿素b（Chl b）、总叶绿素（Chl）和类胡萝卜素（Car）的含量以及Chl a/b的比值。

②抗氧化酶活性测定SOD活性测定按照Beauchamp等[6]的氮蓝四唑（NBT）光还原法进行，以引起50%光化还原抑制率的酶量为一个酶活性单位（U）。CAT活性测定参照Change等[7]的方法，以每1 min OD240值减少0.01为1个酶活力单位（U）。APX活性测定参照Nakano等[8]方法。POD活性测定采用愈创木酚法，通过测定OD460的变化以测定POD的活力[7]。

③脯氨酸含量测定脯氨酸含量测定参照张殿忠等[9]的磺基水杨酸提取法。

④可溶性蛋白含量测定可溶性蛋白含量的测定按照Bradford[10]的考马斯亮蓝G-250染色法，并以标准的BSA作对照。

⑤O2-·生成速率、H2O2和MDA含量测定O2-·生成速率测定采用α-萘胺法[11]，H2O2含量的测定参照Brennan和Frenkel方法进行[12]，MDA含量的测定用硫代巴比妥酸（TBA）法，以μmol·g-1（鲜样质量）表示[13]。

⑥统计分析上述各项指标的测定，均重复3次。采用Excel 2011和SAS软件对数据进行统计分析和差异显著性检验，并作图。

2 结果与分析

2.1 喷施不同浓度ALA对黄瓜叶片光合色素的影响

喷施ALA可以明显改变黄瓜叶片光合色素的含量，不同浓度的ALA的喷施效果差异较大。喷施10、30、50 mg/L ALA可以明显提高黄瓜叶片叶绿素（Chl）和类胡萝卜素（Car）的含量，显著降低了Chl a/b的比值；与喷施清水对照（0 mg/L ALA）相比，黄瓜叶片的Chl a、Chl b、总Chl和Car的含量分别提高了3.92%～10.8%、13.1%～23.7%、6.81%～16.1%和1.26%～7.18%，同时Chl a/b的比值降低了7.92%～12.9%，ALA的作用效果30 mg/L ALA＞50 mg/L ALA＞10 mg/L ALA，30、50 mg/L ALA的作用效果与对照相比均达到了差异显著水平。然而随着ALA浓度继续升高（至100 mg/L），与对照相比，黄瓜叶片的Chl a和Car的含量显著降低；Chl b和总Chl的含量以及Chl a/b的比值无显著变化（表1）。

表1 喷施不同浓度ALA对黄瓜叶片光合色素的影响

表2 喷施不同浓度ALA对黄瓜叶片脯氨酸、可溶性蛋白、H2O2、MDA含量及O2ˉ·生成速率的影响

2.2 喷施不同浓度ALA对黄瓜叶片抗氧化酶活性的影响

与对照相比，4种浓度ALA处理均增加了黄瓜叶片SOD、CAT、APX和POD的活性。但ALA对黄瓜幼苗叶片4种抗氧化酶活性的作用效果不一样，即随着ALA浓度的增加，SOD的活性逐渐增加，而CAT、APX和POD的活性则呈现先增加再减少的趋势。黄瓜叶片SOD、CAT、APX和POD对ALA施用浓度反应也不一样。喷施10、30、50、100 mg/L ALA处理的黄瓜叶片SOD的活性分别增17.4%。48.5%、56.2%、65.7%，且并到达了差异显著水平（P＜0.05），但3种ALA浓度之间没有明显差异。ALA浓度为30、50 mg/L时，对APX、CAT和POD活性的增加效果显著，为1.63～2.15倍；与对照相比，当ALA浓度为50 mg/L时，对APX和CAT活性增加的效果最为明显，分别为93.3%和115.2%，POD活性增加的效果在ALA浓度为30 mg/L时表现的最明显，其活性增加了105.3%。然而，当ALA浓度到达100 mg/L，CAT、APX和POD的活性有一定程度的降低，但仍显著高于对照（P＜0.05）（图1）。

图1 喷施不同浓度ALA对黄瓜叶片抗氧化酶活性影响

2.3 喷施不同浓度ALA对黄瓜叶片脯氨酸和可溶性蛋白含量的影响

喷施10、30、50、100 mg/L ALA的黄瓜叶片脯氨酸的含量显著增加（P＜0.05），与对照相比分别提高了103%、192%、211%和115%。除100 mg/L的ALA处理对黄瓜幼苗叶片中可溶性蛋白含量影响不显著外，其他处理的黄瓜幼苗叶片中可溶性蛋白含量显著地高于对照（P＜0.05），30 mg/L和50 mg/L ALA处理对黄瓜叶片的可溶性蛋白含量增加的效果较好，比对照提高了11.0%和14.3%（表2）。

2.4 喷施不同浓度ALA对黄瓜叶片O2-·生成速率、H2O2和MDA含量的影响

与对照相比，叶面喷施10、30、50 mg/L ALA显著降低了黄瓜叶片O2-·生成速率，这3个ALA浓度处理的黄瓜叶片O2-·生成速率只有对照的61.4%～72.5%，以30 mg/L的ALA处理的O2-·生成速率降低的最为明显；而100 mg/L的ALA处理的黄瓜叶片O2-·生成速率与对照相比差异不显著。叶面喷施ALA对黄瓜叶片H2O2和MDA含量变化的影响效果一致，表现为10 mg/L ALA对黄瓜叶片H2O2和MDA含量没有明显影响；喷施30、50 mg/L ALA的黄瓜叶片H2O2和MDA含量与对照相比分别下降了74.8%～78.9%和69.5%～70.2%；当ALA浓度到达100 mg/L，黄瓜叶片H2O2和MDA含量比对照分别增加了123%、118%，增加效果显著（P＜0.05）（表2）。

3 讨论

在植物体内，ALA是叶绿素和血红素的生物合成的第一个关键前体，CAT、POD和APX同属于亚铁血红素蛋白酶类，因而外源施用ALA，叶绿素含量和抗氧化酶活性的变化最能直观地反映出外源ALA的作用效果[1，14～16]。本研究发现低浓度ALA处理（10～50 mg/L）黄瓜幼苗，不仅能促进黄瓜叶片光合色素Chl a、Chl b、总Chl的增加，还对叶绿素的成分比例产生影响，ALA对Chl b的促进作用效果明显大于Chl a，表现为与喷施清水对照相比Chl a/b的比值明显降低。同时喷施10～50 mg/L ALA可以增加黄瓜叶片抗氧化酶SOD、CAT、APX和POD的活性，提高抗氧化物质Car和Pro的含量，降低了O2-·的生成速率，H2O2和MDA的含量。说明ALA在低浓度下可以促进黄瓜叶片光合色素的合成，增加黄瓜的抗氧化能力，这与前人研究ALA在油菜、番茄、辣椒等植物上施用效果的结果是一致的[14～16]。

ALA对植物生长发育调节作用的效果与ALA的施用浓度和作物种类密切相关，若ALA的浓度使用不当，则调节作用效果减弱，并能对作物生长造成过氧化的伤害[14，17，18]。Zhang等[14]研究表明1 mg/L ALA可以促进油菜的生长，而50 mg/L ALA诱导油菜体内过氧化物质积累，延缓植株的生长。100～400 mg/L ALA喷施红掌幼苗叶片，可显著增加叶绿素的含量，促进幼苗的生长，并以ALA 300 mg/L处理效果最佳[17]。即使在同一种作物上，ALA施用效果也存在着很大的差异[2～4]。本研究发现ALA对黄瓜品种津春4号幼苗的施用效果并不是和ALA的施用浓度成正比，而是存在一个最佳施用浓度，30 mg/L ALA施用效果最明显。当ALA的浓度达到100 mg/L时，黄瓜叶片内的活性氧增加，脂膜过氧化程度增加，叶绿素含量降低，叶片颜色变浅，这可能是与ALA在高浓度下，一方面直接启动细胞过氧化反应，生成如O2-·、H2O2和·OH等活性氧自由基，另一方面ALA代谢合成叶绿素和血红素要经过一些的酶促反应，其中在黑暗条件，ALA可以转化并积累光敏性很强的物质——原卟啉原IX或者原卟啉IX，这些物质如果黑暗中积累过量，再遇光，则诱发单线态氧，导致细胞的过氧化反应，伤害甚至杀死细胞[14，18]。因此在生产上推广应用ALA，其施用方法和浓度必须按照植物的品种特性、施用时期和ALA的纯度等进行严格的筛选，才能达到最佳的施用效果。

综上所述，喷施ALA增强了黄瓜品种津春4号的光合色素的合成能力和抗氧化能力，降低O2-·生成速率，抑制膜脂过氧化的产生；黄瓜叶面喷施ALA的浓度不宜过高，30 mg/L ALA即可达到最佳的施用效果。

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Effects of Spraying Different Concentrations of ALA on Antioxidant Defense System of Cucumber

ZHANG Zhiping,DAI Haibo,GENG Yuan

(College of Horticulture and Plant Protection,Yangzhou University,Jiangsu 225009)

In order to explore the spraying concentrations and effects of exogenous 5-aminolevulinic acid(ALA)on cucumber seedling(Cucumis sativusL.),the experiment was conducted by spraying the Jinchun No.4 cucumber seedlings with different concentrations of ALA.Chlorophyll(Chl)content and the antioxidant enzymes(SOD,CAT,APX,POD)activity,proline and soluble protein content,and superoxide(O2-·)production rate,H2O2and malondialdehyde(MDA)content in leaves were investigated in this paper.The results showed that low concentration of ALA(10、30、50 mg·L-1)treatments could improve the contents of Chl a,Chl b,total Chl and Car,and significantly increase the activity of SOD,CAT,APX and POD and the contents of proline and soluble protein,but largely reduce superoxide(O2-·)production rate,H2O2and MDA content.While high concentration of ALA(100 mg·L-1)induced oxidative stress to cucumber seedlings.In conclusion,ALA application could promote the synthesis of photosynthetic pigments,enhance the capacity of the antioxidant defense system and protect the membrane from peroxidation.The optimum suitable concentration should not exceed 100 mg·L-1,and 30 mg·L-1ALA spraying treatment has the best effects on cucumber seedlings.

Cucumber;5-aminolevulinic acid(ALA);Chlorophyll;Antioxidant enzymes;Oxidative stress

S642.2

A

1001-3547（2017）20-0088-05

10.3865/j.issn.1001-3547.2017.20.031

国家博士后基金项目（2015M580478）；江苏省高校自然科学研究面上项目（15KJB210006）；扬州市自然科学基金——青年科技人才项目（YZ2014024）

张治平（1982-），女，博士，讲师，主要从事蔬菜逆境生理和分子生物学研究，电话：18118251060，E-mail：zhangzp@yzu.edu.cn

2017-06-20