胡德龙

(江苏农林职业技术学院 农学园艺系，江苏 句容 212400)

茄子花青素糖基转移酶基因SmGT的克隆与生物信息学分析

胡德龙

(江苏农林职业技术学院 农学园艺系，江苏 句容 212400)

葡萄糖基转移酶(SmGT)是植物花青素合成途径中的一种关键酶，在植物果实颜色调控方面具有重要的作用。试验以紫色茄子三月茄为材料，设计一对特异性引物，克隆SmGT基因的ORF(开放阅读框)，获得长度为1 413 bp的全长序列。序列分析表明，SmGT肽链含有470个氨基酸，分子量为52.75 ku，等电点为4.98，是一种参与生物体代谢途径的亲水性多肽。结构域和三级结构分析均表明，SmGT含有典型的UDP-葡萄糖基转移酶结构域，是一种糖基转移酶。蛋白质相似性分析表明，SmGT蛋白与马铃薯、野生番茄、辣椒和矮牵牛的葡萄糖基转移酶相似性分别为93%、93%、91%和 87%。SmGT基因的克隆对于研究茄子花青素的生物合成途径以及分子机理具有重要意义。

茄子； 糖基转移酶；SmGT基因； 花青素； 生物信息学分析

茄子(SolanummelongenaL.)属被子植物门，一年生草本植物，原产于东南亚热带地区，遍布世界各地，在亚洲广泛种植，我国种植面积也非常大。茄子果实为浆果，形状各异，有长、圆、椭圆之分。果皮颜色也多种多样，有紫色、白色、绿色等。茄子果皮的颜色呈现主要与其花青素含量密切相关[1]。花青素是决定植物颜色的一种重要物质，目前植物中存在的花青素主要有：天竺葵素、矢车菊素、巧药素、飞燕草素、牵牛花色素和锦葵色素。游离的花青素在植物体内很不稳定，通常会在葡萄糖基转移酶(GT)的作用下形成稳定的花色素苷。花青素(anthocyanidin)广泛存在于茄子、马铃薯、番茄、枇杷、枸杞、桑葚、山楂、葡萄等植物中，近年来，人们对花青素在美容养颜、食品保健、抗炎症、调节血脂中的作用关注度越来越高[2]。植物体内的酶类、过氧化物、pH值、温度、金属离子等均会影响到花青素的稳定性，其中pH值对花青素的稳定性影响最大。花青素在溶液介质中可以发生逆向反应，是以互变的形式平衡存在的；当pH值发生变化时，花青素不同形式之间就会转换，从而导致所表现出来的色泽和颜色强度发生变化[3]。不同果皮颜色茄子的花青素含量不同，其中紫色茄子含量最高，白色茄子含有少量甚至根本没有花青素的存在。

目前，关于花青素合成途径主要集中在前体合成方面的研究，然而对花青素合成途径中花青素修饰方面的研究较少。本研究以紫色茄子三月茄为试验材料，设计特异性引物[4]，克隆SmGT(葡萄糖基转移酶)基因的cDNA全长序列，对其进行核苷酸序列分析、蛋白信号肽预测、结构域预测、蛋白二级结构和三级结构分析、进化树构建以及蛋白相似性比对等生物信息学分析。本研究将为今后研究SmGT基因的功能、探究茄子花青素生物合成调控机制以及进一步揭示不同茄子品种间果皮颜色差异的形成机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

选用三月茄为试验材料，该品种株型紧凑，分枝多，紫白花，果实长卵圆形，紫红色，具有早熟、耐寒、早春坐果率高、肉质细嫩、品质好、适应性广等特性。在温室中用盆钵直播，30 d后取幼嫩叶片进行总RNA的提取。

TaqDNA聚合酶、反转录酶、dNTP等购自大连宝生物公司(TaKaRa)。引物合成和测序均由上海生工完成。

1.2 茄子叶片总RNA的提取及质量检测

将样品加入液氮研磨好后迅速转移到加好溶液的10 mL离心管，离心管内含3 mL硼砂-SDS提取液(SDS 2%，硼砂0.0125 mol·L-1，PVP-40 2%，pH 值8.5)、0.25 mL β-巯基乙醇、2 mL Tris-饱和苯酚和1.5 mL氯仿异戊醇混合液(V∶V为24∶1)，涡旋振荡3 min，冰上放置5 min，于4 ℃，9 600 r·min-1离心20 min。吸取上清至一新离心管，加等体积的异丙醇，-20 ℃下沉淀1～2 h，4 ℃ 9 600 r·min-1离心20 min。倒掉液体，加入3 mL CTAB提取液(1.4 mol·L-1NaCl，0.1 mol·L-1Tris-HCl，pH值8.0，20 mmol·L-1EDTA，2% CTAB，2% PVP，1% β-巯基乙醇，DEPC处理)，用移液枪将沉淀吹到溶解，65 ℃水浴15 min。加等体积氯仿充分混匀，冰浴静置10 min，于4 ℃，9 600 r·min-1离心20 min，将上清转移至一新的10 mL离心管内。加入1/3体积的8 mol·L-1氯化锂，混匀，-70 ℃冰浴，30 min或-20 ℃处理1～2 h，于4 ℃，9 600 r·min-1离心20 min，弃上清，沉淀用70%乙醇洗涤2～3次，9 600 r·min-1离心5 min。吸取乙醇，收集RNA沉淀，抽干后加入50 μL DEPC水溶解。用紫外分光光度计分别测量D260和D280，以双蒸水为对照，用D260/D280的比值来估算总RNA的纯度。通过凝胶电泳系统拍照观察总RNA的完整性。

1.3 cDNA第一条链的合成

将2 μL oligo (dT)，1～5 μg总RNA，2 μL 10 mmol·L-1dNTP混合物，加入到经过处理的无RNA酶的离心管中，用灭菌蒸馏水补至14 μL。将离心管置于70 ℃水浴加热5 min后迅速于冰上冷却2 min，简短离心后加入4 μL 5×First-Strand buffer，1 μL 0.1 mol·L-1DTT(二硫苏糖醇)。加1 μL(200 U)反转录酶并轻轻混匀。于42 ℃温浴50 min，95 ℃加热5 min终止反应。将所得样品置于-20 ℃冰箱长期保存备用。

1.4 SmGT基因引物设计及cDNA全长的克隆

参考李翔等[4]，用Premier 5.0软件设计一对特异引物JZ-F(5′-ATGGTGAAGGCTCATATTAT-3′)和JZ-F(5′-TCAATAACCTTTGGCAACTTCATC A-3′)，以cDNA 为模板，参考反转录酶使用说明书，扩增茄子SmGT基因cDNA 全长序列。PCR反应条件为：95 ℃ 3 min；95 ℃ 40 s，61 ℃ 50 s，72 ℃ 70 s，30 个循环；72 ℃ 10 min，程序结束后将PCR产物进行电泳检测验证，随后将符合预期大小的PCR产物送大连宝生物公司进行测序。

1.5 SmGT基因生物信息学分析

1.5.1 基本理化性质及亲疏水性

用Protparam工具预测氨基酸多肽链的氨基酸组成、等电点、相对分子量、分子式等；用ProtScale工具分析多肽链的亲疏水性。

1.5.2 信号肽及跨膜区

使用SignalP 4.0在线预测信号肽：http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/。使用TMpred预测跨膜：http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html。

1.5.3 亚细胞定位预测

利用MultiLoc2在线预测亚细胞定位: http://abi.inf.uni-tuebingen.de/Services/MultiLoc2。

1.5.4 蛋白质结构域、二级结构和三级结构预测

用InterPro进行结构域分析：http://www.ebi.ac.uk/interpro/。用GOR4工具，对编码蛋白的二级结构进行预测：http://npsa-pbil.ibcp.fr:80/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html。用SWISS-MODEL预测蛋白三级结构：http://www.expasy.ch/swissmod/SWISS-MODEL.html。

1.5.5 蛋白序列同源比对及进化树分析

用Protein BLAST进行蛋白质的同源性比对分析：https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi。用Clustal Omega构建系统进化树：http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/。

2 结果与分析

2.1 茄子总RNA的提取及反转录cDNA的合成

从茄子叶片中提取RNA，经1%的琼脂糖电泳(图1)，显示有28S和18S两条清晰的条带，且28S的亮度是18S的2倍，也没有DNA污染，说明提取的RNA完整性比较好。经过Backman DU800 分光光度计检测，其D260/D280在1.9～2.0，说明RNA纯度比较高，没有蛋白等杂质的污染。

M，DL2000; 1，RNA图1 茄子叶片总RNA的提取

cDNA第一条链的合成，按照TaKaRa反转录试剂盒步骤进行，反转录结果(图2)显示，有弥散状的不同分子量大小的cDNA。说明cDNA质量比较好，可以进行后续实验。

M, DL2000; 1, cDNA图2 cDNA第一条链的合成

2.2 SmGT基因全cDNA全长的克隆及序列

利用设计的特异性引物JZ-F和JZ-R，以上述反转录的cDNA为模板进行PCR扩增，测序结果显示，该基因ORF(开放阅读框)全长为1 413 bp，A碱基数489，占34.4%；G碱基数目295，占20.9%；C碱基数目200，占14.2%；T碱基数目432，占30.6%；A+T占65.0%；G+C 占35.0%(图3)；说明该基因A+T含量较高，与其他物种的糖基转移酶相关基因具有类似特点。

2.3 SmGT蛋白的理化性质

用Protparam软件在线对SmGT氨基酸序列进行分析。结果表明，这是一条含有470个氨基酸残基的多肽链，其蛋白质分子量为52.75 ku，等电点为4.98，分子式为C2384H3683N595O710S22；该蛋白质的半衰期为30 h，不稳定指数为50.53，属于不稳定性蛋白。

灰色底纹代表引物序列；方框代表起始密码子和终止密码子图3 SmGT cDNA全长序列

2.4 SmGT蛋白的亲疏水性

疏水作用是驱使蛋白质折叠的主要动力，蛋白质亲疏水性分析是了解蛋白质折叠的第一步，同时也为蛋白质三级结构预测提供依据，也可用于分析蛋白质相互作用位点。用ProtScale软件对SmGT蛋白进行分析(图4)，总体得分为负数，推测此多肽链为亲水性多肽链。

图4 SmGT蛋白的亲疏水性分析

2.5 信号肽及跨膜区

信号肽是由5～30个氨基酸组成的短肽链，主要作用是指引新合成的蛋白质进行跨膜转移，保证新合成的蛋白质能够准确进行定位运输。本研究利用SignalP 4.1 Server 软件对SmGT信号肽进行预测。一般认为平均信号肽得分大于0.5时，存在信号肽；当小于0.5时，则不存在信号肽。而SmGT蛋白质的氨基酸残基平均信号肽最大得分值为0.347，因此该蛋白不存在信号肽(图5)。

图5 SmGT信号肽预测

跨膜区是跨越细胞膜的蛋白质序列区域，主要由疏水性氨基酸组成，是细胞膜内蛋白质与膜脂结合的关键部位。本文利用TMpred工具对SmGT进行分析，结果显示，该蛋白由外向内、由内向外分别含有4个和6个跨膜区(图6)。

图6 SmGT蛋白跨膜模型

2.6 亚细胞定位预测

利用WoLF PSORT对SmGT蛋白进行亚细胞定位分析表明，此蛋白定位在分泌途径、细胞质、细胞核和线粒体中的可能性分别为57%、35%、5%和4%。故SmGT蛋白很有可能参与了某些代谢途径。

2.7 结构域、二级结构和三级结构预测

用InterPro软件结构域分析，结果显示，SmGT含有典型的UDP-葡萄糖基转移酶基因结构域，是一种糖基转移酶(图7)。

图7 SmGT蛋白保守结构域

用GOR4工具进行二级结构分析，结果显示，共有α-螺旋(Alpha helix)126处，占总二级结构的26.8%；无规则卷曲(Random coil)247处，占总二级结构的52.6%；延伸链(Extended strand)97处，占总二级结构的20.6%(图8)。

图8 SmGT蛋白的二级结构

蛋白质的三级结构是指蛋白质的一条多肽链在二级结构的基础上借助非共价键弯曲，进一步折叠成具有不同球状的构象，来行使不同的功能。用SWISS-MODEL工具对SmGT蛋白进行三维结构预测，结果显示，SmGT是一种UDP-葡萄糖基转移酶，其无规则卷曲占半数以上，这与二级结构的预测结果一致(图9)。

图9 SmGT蛋白空间构象模拟

2.8 蛋白序列同源比对及进化树

将已克隆的SmGT基因ORF序列翻译成多肽链，借助 Protein BLAST工具分析蛋白质的相似性。结果表明，SmGT蛋白与多种植物的葡萄糖基转移酶序列具有很高的同源性，分别为：马铃薯 93%、野生番茄93%、辣椒91%、矮牵牛 87%、野生烟草67%、宁夏枸杞 67%、栀子 62%、滇牡丹 60%、葡萄 60%、核桃 58%、益母草 58%。随后，用Clustal Omega构建进化树，结果表明，茄子SmGT与番茄、马铃薯、辣椒、矮牵牛为一类，亲缘关系比较近；与葡萄、栀子、滇牡丹、核桃的亲缘关系比较远(图10)。

图10 不同植物SmGT蛋白的系统进化树

3 讨论

本研究利用Primer5.0设计一对特异性引物，从紫色三月茄品种中克隆到SmGT基因ORF全长序列。序列分析表明，该基因cDNA全长 1 413 bp，编码470个氨基酸。亚细胞定位分析表明，SmGT蛋白定位于生物分泌途径中的可能性最大，推测其可能参与了某种代谢途径。结构域分析表明，SmGT蛋白含有典型的UDP-葡萄糖基转移酶结构域，属于一种糖基转移酶。二级结构分析表明，SmGT蛋白无规则卷曲所占的比重最大，其次是α螺旋，最后是链的延伸。三级结构分析表明，SmGT是一种UDP-葡萄糖基转移酶，与结构域预测结果一致，具有糖基转移酶的结构特征。蛋白质同源性比对分析，SmGT蛋白与马铃薯、野生番茄、辣椒、矮牵牛等的糖基转移酶同源性在87%以上，进一步说明所克隆的SmGT基因正是茄子的葡萄糖基转移酶基因。进化树分析表明，SmGT蛋白与番茄、马铃薯、辣椒、矮牵牛为一类，亲缘关系比较近；与葡萄、栀子、滇牡丹、核桃的亲缘关系比较远。以上结果均表明，本研究所克隆的SmGT基因是一条完整的ORF，其编码的蛋白为葡萄糖基转移酶。

花青素的种类与含量是导致茄子呈现不同颜色的主要原因，其在保护血管与降低血脂、自由基清除与抗氧化性和消炎等方面都得到了广泛应用[5]，因此具有很好的市场前景。然而，游离的花青素在植物体内很不稳定，通常会在葡萄糖基转移酶(GT)的作用下形成稳定的花色素苷。本研究从三月茄叶片中克隆了SmGT基因，并对其生物学特性、结构域、同源性、进化关系进行了分析，为进一步研究该基因在花青素合成途径中的作用以及分子机理奠定了基础。

[1] 邵文婷, 刘杨, 韩洪强,等. 茄子花青素合成相关基因SmMYB的克隆与表达分析[J]. 园艺学报, 2013, 40(3):467-478.

[2] PASCUAL-TERESA S D, SANCHEZ-BALLESTA M T. Anthocyanins: from plant to health[J]. Phytochemistry Reviews, 2008, 7(2):281-299.

[3] LAPIDOT T, HAREL S, AKIRI B, et al. pH-dependent forms of red wine anthocyanins as antioxidants[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry, 1999, 47(1):67-70.

[4] 李翔, 刘杨, 李怀志,等. 茄花青素5-O糖基转移酶基因克隆与表达特征分析[J]. 上海交通大学学报(农业科学版), 2011, 29(6):1-5.

[5] 李聪, 周玉涛, 朱雪松,等. 原花青素的提取分离及药理作用研究进展[J]. 国际中医中药杂志, 2017, 39(3):285-288.

(责任编辑：张 韵)

2017-09-07

江苏农林职业技术学院科研项目(2014kj16)

胡德龙(1982—)，男，山东泰安人，讲师，博士，研究方向为分子遗传育种，E-mail: hdlhq@163.com。

文献著录格式：胡德龙. 茄子花青素糖基转移酶基因SmGT的克隆与生物信息学分析[J].浙江农业科学，2017，58(11)：2029-2033.

10.16178/j.issn.0528-9017.20171149

S641.1

A

0528-9017(2017)11-2029-05