半夏快速繁殖及乙烯利对其增殖影响

2017-12-06李东海

浙江农业科学 2017年11期

关键词：培苗嫩芽块茎

李东海，汪雷，徐涛

(浙江理工大学生命科学院，浙江杭州 310077)

半夏快速繁殖及乙烯利对其增殖影响

李东海，汪雷，徐涛*

(浙江理工大学生命科学院，浙江杭州 310077)

半夏快速繁殖培养基为MS+6-BA 3.5 mg·L-1；生根培养基为MS+6-BA 3.5 mg·L-1+ NAA 0.5 mg·L-1；在生根培养基中，低强度光照利于半夏组培苗萌发幼芽；高强度光照有利于半夏组培苗幼叶的展开和生长；添加1 000倍商品用乙烯利有利于半夏块茎的膨大和增殖。

半夏；组织培养；快速繁殖；乙烯利

半夏Pinelliaternata又称三叶半夏，为天南星科半夏属多年生草本植物。中华人民共和国药典记载[1]，药用生半夏为半夏植株的干燥块茎，具有燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结的功效，主要用于湿痰寒痰、呕吐反胃、胸脘痞闷、梅核气等，外治痈肿痰核。中国植物物种信息数据库[2]记录，除内蒙古、新疆、青海、西藏尚未发现野生植株外，全国各地均有广布，一般于海拔2 500 m以下草坡、荒地、玉米地、田边、疏林下常见，朝鲜、日本等也有分布。

半夏组织培养一般使用6-BA、NAA、2,4-D等调节剂经过数次继代完成[3-5]，应用于实际生产工艺较复杂，且成本较高[6]。本试验简化了半夏组织培养的继代次数，并使用6-BA、乙烯利[7](化学式为乙烯磷，白色结晶，在常温常压下，能缓慢释放出乙烯)，促进了半夏块茎的增殖。

1 材料与方法

1.1 材料

半夏块茎产地为浙江杭州天目山地区，流水冲洗1～2 h，除去表面土壤，挑选沉入水中且质地坚硬饱满的半夏块茎用于种植，然后清水浸泡，每6～8 h换1次水，共浸泡48～72 h，播种于播种盘中；商用乙烯利购自浙江省花卉市场(浙江省农科院旁)，纯度30%。

1.2 外植体灭菌

选取生长状态良好且未长出珠芽的半夏叶柄，流水冲洗2 h，吸水纸沥干后置于70%乙醇中，快速涮洗1～2次。然后放入含洗涤剂的0.1%HgCl2溶液中，摇匀8 min，用无菌水清洗3～5次，然后置于无菌滤纸片内，去除两端，接种于培养基内。

1.3 无菌苗转接

将接种超过1个月且已分化出叶片的无菌苗用小刀切开，接种于含6-BA 3.5 mg·L-1的MS培养基内。每当植株生长过盛时，即可分离继代。

1.4 培养条件与方法

半夏无菌培养配方：处理1，2,4-D 2.0 mg·L-1，暗培养；处理2，2,4-D 2.5 mg·L-1，暗培养；处理3，2,4-D 2.5 mg·L-1，6-BA 0.5 mg·L-1，暗培养；处理4，NAA 0.5 mg·L-1，6-BA 2.5 mg·L-1，光培养；处理5，6-BA 3.5 mg·L-1，光培养；处理6，NAA 0.5 mg·L-1，6-BA 3.5 mg·L-1，光培养；处理7，2,4-D 2.5 mg·L-1，暗培养→14 d后光培养；处理8，6-BA 3.5 mg·L-1，光培养→14 d后暗培养。

光培养的光照条件为1 000 lx，12 h·d-1；暗培养为避光培养。二者的培养温度均为(25.5±1)℃。

1.5 乙烯利处理半夏无菌苗

乙烯利使用0.22 μm孔径滤膜过滤除菌，然后用纯水分别稀释10、100、1 000倍，待半夏接入不含激素的组培瓶内7 d后，每瓶添加1 mL稀释后的乙烯利。

1.6 半夏组培苗的生根和移栽

将乙烯利处理过的半夏组培苗分离切割，接入6-BA 3.5 mg·L-1和NAA 0.5 mg·L-1的MS培养基内(每瓶内培养基添加较少，半夏块茎需埋入培养基内)。前期光照条件为500 lx，12 h·d-1，培养温度为(25.5±1)℃；待有新芽抽出后转入1 500 lx光照下将移栽的半夏组培苗提前2 d敞开组培瓶盖，加入清水浸没块茎。然后植入灭菌过的土壤内，覆上干苔藓或干草。

2 结果与分析

2.1 培养处理对半夏愈伤组织的诱导

表1为8种培养条件下半夏的生长情况。以接种30 d统计性状，并记录愈伤诱导率和嫩芽诱导率。其中，处理1、2、3形成半透明的泡状细胞，无组织分化倾向(分化情况a)；处理4在7 d左右茎叶卷曲，有类似珠芽萌发于创口，20 d左右先萌发根，后长出叶片(分化情况b1)；处理5在7 d左右茎叶卷曲，有类似珠芽萌发于创口，20 d左右长出叶片，但不萌发根(分化情况b2)；处理6在7 d左右茎叶卷曲，有类似珠芽萌发于创口，20 d左右长出叶片，萌发根(分化情况b3)。处理7的泡状细胞偶有绿色星点位于细胞表面，后来无明显变化(分化情况c)；处理8珠芽继续萌发生长，长出白色茎叶，无根(分化情况d)。

表1 不同培养处理条件下半夏组织培养情况对比

2.2 半夏的芽增殖培养

如图1所示，半夏在6-BA 3.5 mg·L-1培养基中培养，3 d时接种外植体切口处开始外翻；8 d时全部呈现泡状，有白色嫩芽开始分化，出现于切口处；13 d时大量嫩芽出现，茎干中断也有大量嫩芽；21 d时产生大量愈伤组织，原本嫩芽部分开始萌发出芽；28 d时大量芽分化萌发出来，开始出现叶片，整个植株团簇状；35 d时叶片形成，少数开始生长出根部。

图1 半夏增殖培养生长状况

2.3 半夏组培苗的生根诱导和移栽

如图2所示，半夏无菌苗接入并浸入6-BA 3.5 mg·L-1和NAA 0.5 mg·L-1的MS培养基内，大约15 d左右有根诱导分化(A)；将其放置于低强度光照条件下，会有大量芽分化出来(B)；然后将其转移至稍强光照后，原本幼叶展开，并增大至正常形态(C)；将炼苗后的半夏组培苗种植于花盆内，并附上干苔藓(D)。

图2 半夏组培苗的后期处理

2.4 乙烯利处理下半夏的块茎变化

如图3所示，正常组织培养状态半夏块茎簇集成大团，青绿色，且一般块茎上存在着半夏幼苗的萌芽，生长活力好，质地较为坚硬，有光泽(A)；0.1%乙烯利时，半夏块茎仍为青绿色，生长活力较好，质地稍微松软(B)；1%乙烯利时，块茎由青绿色转为土黄色，活力逐渐丧失，质地也更为松软(C)；当乙烯利浓度达到10%时，半夏块茎全部变为土黄色，簇集成团的块茎松散开来，大部分块茎呈现糜烂状态，几乎完全丧失了活性，即使后期更换正常培养后，无明显改变(D)。

图3 不同浓度乙烯利催化后半夏块茎生长状况

3 小结与讨论

光照对半夏嫩芽和芽的分化是必要条件，当无光照培养时，半夏易于产生愈伤组织；当光照强度在500 lx时，半夏生长和芽的分化较多；光照强度在1 500 lx时，有利于叶片的伸展和增大。在生长调节剂选取方面，6-BA和NAA均对半夏组织培养有促进作用，但6-BA更能影响半夏的嫩芽生成和幼芽的萌发，NAA促进半夏的根的诱导，2,4-D则有利于愈伤组织的分化。从试验中可以看出，0.1%乙烯利能促进半夏生长，增加组培瓶内半夏块茎的增殖，但不影响块茎的生成和其营养物质的积累；而更高浓度的乙烯利则抑制半夏生长，降低块茎的活性，使其营养物质积累受阻，部分开始降解、自溶。

本试验使用配方简单，易于操作，且增殖系数大。通过调节光照强度，省略了传统组织培养的愈伤组织的脱分化和芽诱导步骤，直接从外植体分化出幼芽，并扩增幼芽的基数，促进叶片的展开和生长。在实际生产应用中，一定程度上减少了无菌苗的转接次数，减少污染的可能；由于培养基更换量较少，降低了半夏组织培养的成本，节约了培养时间，适宜实际生产应用。

[1] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典1部[S]. 北京：中国医药科技出版社，2015.

[2] 中国科学院. 中国植物物种信息数据库[DB/OL]. http://db.kib.ac.cn/eflora/view/search/Chs_contents.aspx?CPNI=CPNI-128-15201.

[3] 刘鑫欣，崔晓星，刘金欣，等. 不同植物生长调节剂对半夏愈伤组织诱导效应的研究[J].中国中医药信息杂志，2011(5)：57-59.

[4] 宋艳梅，李峰，刘杨. 半夏组织培养快速繁殖研究[J]. 山东中医药大学学报，2010(4)：368-369.

[5] 贾明良，方荷芳，张本厚. 三叶半夏丛生块茎途径扩繁及块茎分离技术研究[J]. 中国农业科技导报，2016(6)：181-186.

[6] 赵桂芳. 半夏组织培养成本分析[J]. 现代农业科技，2015(10)：91-92.

[7] 祁利潘，孙明磊，李梦. 乙烯利对“冀张薯8号”产量和耐贮性的影响[C]//中国作物学会马铃薯专业委员会会议论文集，2016.

(责任编辑：张瑞麟)

2017-09-06

国家自然科学基金(30772712)

李东海(1988—)，男，湖北武汉人，硕士研究生，从事药用植物代谢方面的研究工作，E-mail：493539063@qq.com。

徐涛(1962—)，男，教授，从事药用植物快速繁殖和代谢方面的研究工作，E-mail：pkuxt@aliyun.com。