沈国正，刘 辉*，李白沙，张 琛，黄康康，郗笃隽，裴嘉博，张 青，裘劼人

(1.杭州市农业科学研究院，浙江 杭州 310024； 2.杭州市临安区林业技术推广中心，浙江 杭州 311300)

红阳猕猴桃与杭州地区部分野生猕猴桃种质的SSR分析

沈国正1，刘 辉1*，李白沙1，张 琛1，黄康康1，郗笃隽1，裴嘉博1，张 青2，裘劼人1

(1.杭州市农业科学研究院，浙江 杭州 310024； 2.杭州市临安区林业技术推广中心，浙江 杭州 311300)

以杭州地区种植的中华猕猴桃红阳、美味猕猴桃海沃德、徐香、金魁及11份本地野生猕猴桃为试材，对其SSR遗传多样性及其亲缘关系进行分析和评价。结果表明，利用16对引物15份材料上均扩增出多态性片段，共计得到88条多态性条带，检出81个等位变异点，遗传相似系数(GS)变异范围为0.58～0.91。GS值在0.60水平上UPGMA聚类分析可将供试的猕猴桃种质资源划分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ共4个组。这些遗传变异丰富的种质资源可为今后利用本地猕猴桃资源开展育种研究提供理论依据。

红阳猕猴桃； 野生猕猴桃； SSR标记； 遗传多样性； 杭州

猕猴桃为多年生雌雄异株落叶藤本植物，我国是猕猴桃的原产地，目前全世界66种猕猴桃属植物中，有62种均产于我国，且绝大部分为我国特有，种质资源十分丰富。目前国内外猕猴桃品种选育主要从野生种质资源中选择或杂交育种[1]，丰富的野生猕猴桃种质资源是猕猴桃品种选育和产业可持续发展的基础[2-3]。20世纪70年代以来，我国已从野生猕猴桃资源中选育出55个品种和200多个优良株系，猕猴桃产业迅速发展[4]。但异地间品种交换频繁，且猕猴桃属中普遍存在自发的种间杂交和种内多倍化现象，使得品种资源的混杂现象比较突出，也不利于新品种的选育。

微卫星DNA，即简单重复序列(SSR，simple sequence repeats)标记以其共显性、重现性良好和多态性丰富等优点，成为构建品种指纹的重要标记，广泛应用于农作物和果树的品种鉴定和种质资源分析。宋晓燕等[5]用12对SSR引物评价192份二倍体马铃薯栽培品种的遗传多样性，检测到98个等位位点并划分为11个组群。高源等[6]利用TP-M13-SSR标记，基于TP-M13-SSR指纹图谱构建苹果种质分子身份证。高天翔等[7]用11对SSR引物对中国樱桃14个自然居群280个个体分析评价遗传多样性和遗传结构。这些研究结果都证实了SSR标记分析遗传关系的有效性。本研究利用SSR标记对杭州地区发展较快的红心猕猴桃品种红阳与杭州建德筛选到的优质野生猕猴桃材料及其他主栽品种进行初步研究，拟分析它们之间亲缘关系的远近，为新品种的选育提供遗传学基础数据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

2015年5—8月对杭州地区主要栽培品种和野生猕猴桃(主要在杭州建德)进行了普查，选取近年来栽培较多的品种中华猕猴桃栽培种红阳，美味猕猴桃栽培种海沃德、徐香、金魁以及收集到的建德野生猕猴桃11份，共15份材料。采集供试材料的叶片(野生猕猴桃为幼嫩叶片，其余品种为成熟叶片)用冰盒保存并运回实验室，置于-20 ℃低温冰箱中保存备用。

1.2 方法

采用改良CTAB法[8]从100 mg供试材料叶片中提取基因组DNA，用微量核酸浓度仪(BioSpec-nano)和1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度和质量，并将模板浓度调至200 ng·μL-1。DNA母液于-20 ℃冰箱保存。对Huang等[9]报道的应用于猕猴桃的微卫星位点进行筛选，筛选出适用于供试材料的多态性好的引物16对(表1)。引物由上海生工合成。

表1 猕猴桃SSR分析的16对引物及退火温度

PCR反应体系及条件(PCR所用试剂购自博大泰克)。反应程序如下：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性20 s，55～57 ℃退火10 s，72 ℃延伸20 s，35个循环；72 ℃后延伸2 min。反应结束控制在4 ℃。PCR产物使用微芯片毛细管电泳仪(MCE-202 MultiNA，岛津)进行片段分析。电泳试剂使用DL-500试剂盒(岛津)，25 bp DNA ladder(Invitrogen，1×TE稀释50倍)，SYBR® GOLD荧光染料(1×TE稀释100倍)。

1.3 数据分析

根据SSR分析的结果，将每条SSR引物扩增出的每条带视为1个位点，相同迁移率的记为1，无条带的记为0，在Excel 2007中将片段大小统计转化为0/1矩阵。使用NTSYS-pc 2.1软件，通过similarity→clustering→SHAN→Graphics→tree plot，程序得到15份材料的亲缘关系聚类图。

2 结果与分析

2.1 15份猕猴桃材料的遗传多样性

通过引物筛选预实验，选定了16对多态性好的引物UDK96-1、UDK96-15、UDK96-16、UDK96-20、UDK96-22、UDK96-26、UDK96-34、UDK96-37、UDK96-40、UDK97-401、UDK97-403、UDK97-407、UDK97-409、UDK97-413、UDK97-414、UDK97-415。利用这些引物对4个主栽猕猴桃品种和11份野生猕猴桃材料进行扩增，发现其在所有供试材料中均可扩增出清晰条带；共获得88条多态性条带，平均每对引物扩增4.2条带，每个位点均呈现出一定的多态性(表2)。其中，利用UDK97-407进行扩增，发现红阳没有条带，其余14份材料均有条带(图1)。结果表明，引物扩增得到的基因片段长度在80～300 bp，PCR扩增总计得到81个等位位点，平均每对SSR引物可以检测到5.06个等位位点。

表2 15份猕猴桃材料的SSR指纹图谱

1～11为野生材料；12为红阳；13为海沃德；14为徐香；15为金魁图1 UDK97-407在15份猕猴桃样本上的扩增结果

2.2 聚类分析

通过SSR多态性标记分析，15份猕猴桃种质资源的遗传相似系数(GS)变异范围为0.58～0.91，大部分野生材料与品种间的亲缘关系较远。其中，野生猕猴桃种质材料1和2的GS值最大，表明两者亲缘关系近，与其他样本间的亲缘关系较远；11和红阳之间亲缘关系较近。

根据材料间的遗传相似系数，采用UPGMA法对猕猴桃种质资源进行聚类分析(图2)，利用16对SSR引物能将15份种质资源相互区分，在GS值0.60的水平上将所有的材料划分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ4个组。Ⅰ组包括了野生种质资源1和2，Ⅱ组包括了野生种质资源3、5、10和栽培品种海沃德，Ⅲ组包括了野生种质资源11和栽培品种红阳、徐香和金魁，Ⅳ组包括了野生种质资源4、6、7、8和9。

图2 15份猕猴桃样本的聚类分析

3 讨论

选择优良性状的亲本材料是进行猕猴桃育种工作的前提和基础，亲本材料遗传背景狭窄则会导致难以培育出优良性状的品种。因此，通过选择变异来源广泛的亲本材料，比较材料间亲缘关系的远近，对于猕猴桃新品种的选育和品种改良工作具有重要意义。利用SSR分子标记技术进行猕猴桃遗传多样性的研究，国内外已有许多相关报道。郑轶琦等[10]利用9对SSR引物，对中国栽培的48个猕猴桃品种(品系)进行了遗传多样性研究表明，中国猕猴桃栽培品种具有较高的遗传多样性，SSR标记在猕猴桃品种中有较高的鉴定效率；易盼盼等[11]通过对51对SSR引物的筛选，获得了与抗溃疡病基因连锁的SSR分子标记UDK97-428116，为猕猴桃抗病育种提供早期分子筛选标记；王丹丹等[12]利用21对引物对25份软枣猕猴桃建立了EST-SSR反应体系，为猕猴桃属植物的形状定位、品种鉴定、种质创新、新品种培育及遗传多样性分析等工作奠定了基础。众多研究结果表明SSR标记是进行猕猴桃品种鉴定的有效工具，与其他标记相比，SSR标记在鉴定猕猴桃品种的研究中显示更高的效率。

本研究中各猕猴桃种质资源材料之间的遗传相似系数为0.58～0.91。魏艳霞等[13]利用RAPD标记对野生猕猴桃资源遗传分析发现个别材料遗传相似性系数较高，在0.14～0.85，应该加强野生资源的收集和利用研究。从聚类结果可以发现，海沃德虽然与徐香、金魁同属美味猕猴桃，却与其他2个品种间的亲缘关系较远；红阳属中华猕猴桃，与徐香、金魁却相近，这与前人关于部分中华和美味品种间亲缘关系相近的研究相符合，说明美味猕猴桃作为中华猕猴桃的变种，具有很近的亲缘关系[14-16]。本研究为利用杭州地区丰富的野生猕猴桃资源开展新品种选育提供理论基础。

[1] 黄宏文，龚俊杰，王圣梅，等. 猕猴桃属(Actinidia)植物的遗传多样性[J]. 生物多样性，2000，8 (1)：1-12.

[2] HUANG H W，WANG Y，ZHANG Z H，et al.Actinidiagermplasm resources and kiwifruit industry in China[J]. HortScience，2004，39 (6)：1165-1172.

[3] FERGUSON A R，HUANG H W. Genetic resources of kiwifruit：Domestication and breeding [J]. Horticultural Reviews，2006，33：1-121.

[4] 黄宏文. 猕猴桃驯化改良百年启示及天然居群遗传渐渗的基因发掘[J]. 植物学报，2009，44(2)：127-142.

[5] 宋晓燕，张春芝，李颖，等. 二倍体马铃薯栽培品种遗传多样性的SSR标记分析[J]. 园艺学报，2016，43(11)：2266-2276.

[6] 高源，王昆，王大江，等. 利用TP-M13-SSR标记构建苹果栽培品种的分子身份证[J]. 园艺学报，2016，43(1)：25-37.

[7] 高天翔，蔡宇良，冯瑛，等. 中国樱桃14个自然居群遗传多样性和遗传结构的SSR评价[J]. 园艺学报，2016，43(6)：1148-1156.

[8] 丁建，董晓莉，郑晓琴，等. 一种简便高效提取猕猴桃DNA的方法[J]. 资源开发与市场，2006，22(5)：401-402.

[9] HUANG W G，CIPRIANI G，MORGANTE M. Microsatellite DNA inActinidiachinensis：isolation，characterization，and homology in related species[J]. Theor Appl Genet，1998，97(8)：1269-1278.

[10] 郑轶琦，李作洲，黄宏文. 猕猴桃品种 SSR 分析的初步研究[J]. 武汉植物学研究，2003，21 (5)：444-448.

[11] 易盼盼，樊红科，雷玉山. 猕猴桃抗溃疡病基因连锁SSR分子标记初步研究[J]. 西北农林科技大学学报(自然科学版)，2015，43(4)：91-98.

[12] 王丹丹，牟元珍，杨东霞. 软枣猕猴桃EST-PCR体系建立及品种遗传关系[J]. 辽东学院报，2016，23(3)：177-182.

[13] 魏艳霞，豁泽春，王飞，等. 野生猕猴桃DNA的提取及RAPD分析体系的建立[J]. 西北农业学报，2008，17(2)：169-173.

[14] FERGUSON A R. The need for characterisation and evaluation of germplasm：kiwifruit as an example[J]. Euphytica，2007，154 (4)：371-382.

[15] HUANG H，FERGUSON A R.Actinidiain China：natural diversity，phylogeographical evolution，interspecific gene flow and kiwifruit cultivar improvement[J]. Acta Horticulturae，2007，753 (1)：31-40.

[16] 井赵斌，徐明，雷玉山. 猕猴桃SRAP-PCR体系的建立及品种资源亲缘关系研究[J]. 园艺学报，2016，43(2)：337-346.

(责任编辑：张瑞麟)

2017-06-19

杭州市科技计划项目(20140932H03)

沈国正(1968—)，男，高级农艺师，从事果树栽培技术研究及推广工作，E-mail：sgz@hz.cn。

刘 辉，E-mail：liuhui518lh@163.com。

文献著录格式：沈国正，刘 辉，李白沙，等. 红阳猕猴桃与杭州地区部分野生猕猴桃种质的SSR分析[J].浙江农业科学，2017，58(11)：1906-1909.

10.16178/j.issn.0528-9017.20171114

S663.4

A

0528-9017(2017)11-1906-04