苏花 周珅玥 郭新程 王海青 李翠 黄建华

LncRNA H19与OSF发生及癌变的关系

苏花 周珅玥 郭新程 王海青 李翠 黄建华

目的探讨lncRNA H19在口腔黏膜下纤维性变(OSF)发生及癌变过程中的表达变化及其意义。方法实时荧光定量PCR技术分别检测12 例正常颊黏膜组织、33 例OSF颊黏膜组织、31 例伴OSF颊癌组织中的LncRNA H19的表达水平。结果LncRNA H19在颊黏膜组织、OSF颊黏膜组织、伴OSF颊癌组织中的相对表达量分别为1.17±0.37、3.44±1.08、8.88±1.78，组间两两之间比较，Plt;0.01。结论LncRNA H19可能参与OSF的发生及癌变。

口腔黏膜下纤维性变； 癌变； LncRNA H19

口腔黏膜下纤维性变(oral submucous fibrosis，OSF)由Schwartz在1952年首次报道并命名，是一种慢性进行性并且具有癌变倾向的口腔黏膜疾病，主要发生于印度、巴基斯坦等东南亚地区，我国主要见于湖南和台湾2 省[1]。1956 年Paymaster[2]首次报道OSF具有癌变倾向，之后的研究也证实了类似现象，并被WHO口腔癌前病变研究中心列为癌前状态，但报道的癌变率存在较大差异，区间在2%～8%之间[1]。近年来，针对OSF的具体发病机制及癌变诱导因素的研究不断被报道，现已发现槟榔中的槟榔碱、亚硝基胺和烟草中的尼古丁等致癌成分能够参与OSF的癌变，然而具体诱变机制仍然不清楚[3-4]。

长链非编码RNA(lncRNA) 是一类长度大于200 个核苷酸、不具有蛋白质编码功能的转录本，以往一直被认为是转录的暗物质和副产物[5]。但近年来的研究表明lncRNA在剂量补偿效应、表观遗传调控、细胞周期调控和细胞分化调控等众多生命活动中发挥重要作用，其表达紊乱与多种人类疾病的发生发展密切相关，且在肿瘤的发生发展中起着重要作用[5-7]。H19 是第一个被发现与肿瘤相关的lncRNA，仅在胚胎组织中表达，在成年组织中一般不表达，但在组织再生及肿瘤发生时被重新激活[8]。LncRNA H19的印迹缺失已经被认为是癌症发生的早期事件，在肿瘤的发生、发展过程中扮演着非常重要的角色，是继p53 基因之后在肿瘤分子生物学上又一重大发现[9]。目前国内外均有大量文献研究H19在不同疾病和肿瘤中的表达及作用机制[6-7]，OSF作为癌前状态，具有一定的癌变倾向，而关于H19在OSF的发生及癌变过程中所扮演的角色目前尚无相关报道。我国湖南省、海南省及台湾作为世界上口腔黏膜下纤维化及口腔癌发生率较高的地区，研究口腔黏膜下纤维化发生发展及癌变过程中可能存在的特异性标记分子，为针对性基因治疗提供理论基础具有重要意义。本研究采用实时荧光定量PCR技术初步研究了H19在正常颊黏膜、OSF、伴有OSF颊癌组织中分子水平的表达，探索H19在OSF发生及癌变过程中的潜在临床意义。

1 材料与方法

1.1 临床标本收集

选2014-01～2014-09中南大学湘雅三医院口腔科及中南大学湘雅医学院附属肿瘤医院头颈外科就诊及住院的OSF患者及伴OSF颊癌患者共64 例，均未经特殊治疗、无其他系统疾病，其中口腔黏膜下纤维性变患者33例，伴口腔黏膜下纤维性变颊癌患者31 例(均为患者先出现OSF症状,后出现口腔癌变,取其口腔癌变组织部分)，正常口腔颊黏膜组织12 例(均为志愿者，且无烟、槟榔嗜好，无口腔黏膜疾病)，上述标本依次分入OSF颊黏膜组、伴OSF颊癌组和正常颊黏膜组。所有患者均签署知情同意书，活检组织标本分2 份，一份固定于10%甲醛溶液中送中南大学湘雅三医院病理科获得病理诊断书，另一份于液氮罐中保存。

1.2 材料

Trizol(美国 Invitrogen)，逆转录试剂盒(立陶宛 Fermentas)，SYBR Green PCR Master Mix(美国 ABI)，Tris、琼脂糖、DEPC水(美国 Sigma),引物由南京金斯瑞公司合成。其他常用试剂均为国产分析纯试剂。

1.3 方法

1.3.1 总RNA提取 正常颊黏膜组织、OSF颊黏膜组织和伴有OSF的颊癌组织从液氮中取出后，迅速在液氮下研磨组织标本，使用Trizol法对研磨后的组织进行RNA抽提，按说明书操作要求抽提总RNA，用紫外分光光度仪测定RNA A260和A280的吸光度值。RNA纯度=A260/A280，实验中比值均在1.8～2.0之间，表明样本纯度较好，无明显污染。进一步采用1%琼脂糖凝胶电泳法检测RNA的质量。

1.3.2 cDNA 反转录合成 按逆转录试剂盒说明书，取1 μg RNA，依次加入反应试剂，以终体积20 μl反应体系进行 cDNA 反转录合成。反应程序为：65 ℃ 10 min，42 ℃ 15 min，70 ℃ 5 min。反应产物于-20 ℃保存备用。

1.3.3 实时荧光定量检测 参照SYBR Green PCR Master Mix(美国 ABI)试剂盒说明书，采用7900HT Fast Real-Time PCR仪( 美国ABI)进行qRT-PCR反应检测组织中lncRNA H19的表达水平。H19上游引物序列：5'-CCGTCTCCACAACTCCAACCAG-3'，下游引物序列5'-TCAAAGCCTCCACGACTCTGTTT-3'。使用GAPDH作为内参基因，GAPDH的上游引物序列：5'- CATCCTGCGTCTGGACCTGG-3'，下游引物序列：5'-TAATGTCACGCACGATTTCC-3'。反应条件: 95 ℃ 10 min, 1 个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40 个循环。上机反应后的数据先用内参基因GAPDH进行标化，并用2-ΔΔCT值来表示lncRNA H19的相对表达水平。每个样本检测均重复3 次，取其平均值。

1.4 统计学分析

以上数据均采用统计学软件SPSS 18.0进行数据处理，首先用完全随机方差分析分析，得出有差异以后，再用Dunnet-t检验进行两组之间的比较，Plt;0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 实时荧光定量PCR检测H19基因的表达水平

正常颊黏膜组织、OSF颊黏膜组织和伴有OSF的颊癌组织中均检测到H19基因的表达，经正态性检验，符合正态分布(Pgt;0.05)。正常颊黏膜、OSF颊黏膜组织和伴有OSF的颊癌组织中H19基因的相对表达量分别为1.17±0.37，3.44±1.08，8.88±1.78(图 1～3)。

图 1 H19在正常颊黏膜中的表达水平

2.2 H19基因在OSF组织、OSF癌变组织和正常颊黏膜组织中的表达情况

采用Dunnet-t检验进行两两之间的统计比较，结果显示，H19基因在伴有OSF的颊癌组织较OSF颊黏膜组织中的表达水平明显升高(Plt;0.01)，其在OSF颊黏膜组织中的表达水平比正常颊黏膜组织中的表达水平也明显升高(Plt;0.01)(图 4)，且H19基因在正常颊黏膜、OSF颊黏膜组织中和伴有OSF的颊癌组织中的相对表达量成升高趋势。

图 2 H19在OSF颊黏膜组织中的表达水平

图 3 H19在伴OSF颊癌组织中的表达水平

图 4 3 组样本中H19相对表达量的比较

3 讨 论

LncRNA H19是最早发现的一种长链非编码RNA，定位于人染色体llpl5.5区。在正常组织内，H19为母系等位基因表达，父系等位基因沉默的印迹基因。印迹基因表达异常，包括印迹获得(gain of imprinting，GOI)和印迹丢失(loss of imprinting，LOI)，可引起一系列生理病理改变甚至肿瘤的发生。研究表明，H19在多种肿瘤中都存在异常表达，异常表达的H19能够影响肿瘤的侵袭转移、细胞增殖分化、血管形成等生理过程从而促进肿瘤的发生发展[10]。而对人类口腔黏膜及其癌前病变的lncRNA 表达图谱分析[11]，发现了超过60% lncRNA(325 种)在癌组织中存在异常表达，其中包括lncRNA H19，但尚无相关功能研究报道。

口腔黏膜下纤维化作为一种癌前状态，具有一定的癌变能力。因此，寻找能够指示导致口腔黏膜下纤维病变的特异性标记分子，对预防口腔黏膜下纤维性变的发生及癌变具有重要意义。近年来的研究发现成纤维细胞，尤其是肌成纤维细胞在OSF的发生中发挥重要作用[12]。异常表达的H19基因在纤维化的发生过程中的相关研究已有报道，如章杰等[13]首次报道了H19 的过量表达与瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖密切相关，下调H19的表达可以抑制mTOR 和 VEGF 的产生，从而抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖。而H19基因在不同阶段的口腔病理状态的表达水平及其与OSF发生发展之间的关系目前还未见报道。

本研究从3 个不同阶段的口腔病理状态着手，通过反转录及实时荧光定量PCR检测了正常颊黏膜组织、OSF颊黏膜组织和伴有OSF的颊癌组织中3 个不同阶段H19的表达水平，结果表明，H19的表达在3 个不同阶段的口腔病理状态呈逐渐增高的趋势，H19基因在伴有OSF的颊癌组织较OSF颊黏膜组织中的表达水平明显升高，其在OSF颊黏膜组织中的表达水平比正常颊黏膜组织中的表达水平也明显升高，表明H19和口腔黏膜纤维化的发生及癌变有一定的联系，提示H19具有成为口腔黏膜下纤维性变发生发展及癌变的生物标记物的可能，为其后续的实验研究及相关临床应用奠定了基础,研究将进一步探讨H19在口腔黏膜下纤维化发生发展及癌变过程中的生物学功能及其作用机制，明确其表达升高的原因及其与OSF的预后之间的关系。

综上所述，H19在OSF组织和伴有OSF的颊癌组织表达明显上调，提示H19可能参与了OSF的发生及癌变，可作为口腔黏膜下纤维性变的潜在生物标记物，其具体的机制有待进一步深入研究。

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(收稿： 2016-12-24 修回： 2016-01-21)

TherelationshipofLncRNAH19withtheoccurrenceandthecarcinogenesisofOSF

SUHua,ZHOUShenyue,GUOXincheng,WANGHaiqing,LICui,HUANGJianhua.

410013Changsha,DepartmentofStomatology,thirdXiangyaHospital,CentralSouthUniversity,China

Objective: To study the significance of H19 gene in the progress from normal mucosa through oral submucous fibrosis(OSF) to carcinogenesis.MethodsReal-time fluorescent quantitative PCR technique was used to detect LncRNA H19 expression level in 12 cases of normal buccal mucosa tissue, 33 cases of OSF buccal mucosa tissue and 31 cases of buccal carcinoma with OSF.ResultsThe relative expression levels of LncRNA H19 in normal buccal mucosa tissues, OSF buccal mucosa tissue and buccal carcinoma with OSF tissue were 1.17±0.37, 3.44±1.08 and 8.88±1.78 respectively(between each 2 groups,Plt;0.01).ConclusionH19 may involve the occurrence and canceration of OSF.

Oralsubmucousfibrosis(OSF);Carcinogenesis;LncRNAH19

2015 湖南省保健专项资金科研课题( 编号: B2015-05)

410013 长沙，中南大学湘雅三医院口腔科

郭新程E-mail: guoxinchengf3@126． com

R739.8

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.02.020