邱喜丽 许春姣 王璐 吕逢源 刘婷婷 周美璐 徐文华 吴颖芳 方厂云 彭解英

Wnt1在口腔黏膜下纤维性变中的表达

邱喜丽 许春姣 王璐 吕逢源 刘婷婷 周美璐 徐文华 吴颖芳 方厂云 彭解英

目的研究wnt1在口腔黏膜下纤维性变(OSF)患者治疗前后的表达并探讨其在OSF发生发展中的作用。方法40 例OSF中期患者采用曲安奈德+丹参局部封闭治疗4 周，治疗前及第5周复诊时记录VAS及张口度，取唾液及龈沟液ELISA检测wnt1表达，实时荧光定量PCR检测OSF病变颊黏膜中wnt1 mRNA表达。结果治疗前OSF组wnt1表达[颊黏膜定量PCR(36.89±10.40)×10-5，唾液浓度(61.61±4.45) ng/L，龈沟液浓度(56.20±3.65) ng/L]均高于正常组[颊黏膜定量PCR(4.63±1.53)×10-5，唾液浓度(40.26±3.00) ng/L，龈沟液浓度(53.45±1.74) ng/L](Plt;0.01)；OSF组经治疗后，唾液与龈沟液中wnt1表达均降低，且与OSF临床严重程度呈正相关(Plt;0.05)。结论wnt1可能参与OSF的发生发展，其在唾液与龈沟液中的实时监测有望成为评价OSF诊疗的无创性检控手段之一。

口腔黏膜下纤维性变(OSF)； wnt1； wnt/β-catenin信号通路

口腔黏膜下纤维性变(oral submucous fibrosis,OSF)是一种具有癌变倾向的斑纹类疾病，临床表现为张口受限、刺激性疼痛和水疱、溃疡等，其发生与咀嚼槟榔密切相关[1]，国际上常采用糖皮质激素、蛋白水解酶、抗氧化剂、维生素等药物治疗，但尚未发现安全特效的治疗方法。近年我科采用曲安奈德结合丹参治疗OSF收到良好疗效。OSF的发病机制目前尚不明确，大量研究表明，wnt/β-catenin信号通路在肝、肾、肺、皮肤等器官纤维化进程中起到了关键作用，尤其在成纤维细胞的增殖及向肌成纤维细胞的分化中起着调控作用[2]，wnt1是该信号通路的起始蛋白，但在OSF中的研究甚少，鉴于器官纤维化的同质性，推测其可能在OSF中起着一定作用。

目前，局部活检仍是临床上常用的诊断OSF的主要方法，但存在有创和术后疼痛等缺点，给治疗及疾病预后的监控带来难题。而唾液及龈沟液取样方法简单快捷，安全无创，易被患者接受，已被用来监测牙周和口腔黏膜疾病状态。故本研究通过检测OSF患者治疗前后唾液及龈沟液中wnt1蛋白的表达水平及临床指标的改变，探讨wnt1与OSF的发生发展关系，为其疗效评价提供新途径。

1 资料与方法

1.1 研究对象

研究2012-03～2014-05于中南大学湘雅医院口腔科就诊患者，均取得知情同意完成本项研究。OSF组纳入标准[3]：未经过治疗的病理诊断为OSF中期患者。排除标准[3]：合并系统性疾病、牙周炎、其余口腔黏膜疾病。共纳入18～50 岁的OSF患者40 例；唾液及龈沟液取样正常对照组20 例，正常颊黏膜组织20 例取自湘雅医院口腔颌面外科病房行骨折固定术者。

1.2 治疗方案

OSF组：10 mg/ml曲安奈德注射液4 ml，1.5 g/ml丹参注射液4 ml，注射于双侧病损基底部，1 次/周，连续4 周，戒除槟榔、烟、酒，行张口训练，同时服用钙片、氯化钾缓释片和葡萄糖酸锌颗粒。

1.3 主要试剂、材料及设备

MB-530多功能酶标分析仪(深圳汇松科技发展有限公司)，荧光定量PCR仪(Thermo公司,美国)，wnt1酶联免疫分析试剂盒(RD公司,美国)，逆转录试剂盒(Fermentas公司,美国)，SYBR Green PCR Master Mix(ABI公司,美国)。

1.4 临床资料采集

患者初诊及第5周复诊时，拍摄口内照片，记录基本信息、生活习惯、刺激痛、张口度、水疱和溃疡。刺激痛评价采用视觉模拟评分法(visual analogy scale，VAS)，由患者根据自我疼痛程度来从0～100内选择相应分数，0代表无疼痛，100代表疼痛最高值。

1.5 唾液及龈沟液采集及ELISA检测wnt1浓度

在初诊及第5周复诊时，采取静态吸引法收集无刺激性混合唾液1 ml[4]，采取标准whatman滤纸条[2 mm×20 mm]分别插入4 个第一磨牙近中颊侧龈沟内收集龈沟液，置-80 ℃冰箱保存，采用wnt1酶联免疫分析试剂盒检测wnt1的浓度。

1.6 颊黏膜组织收集

OSF受试对象选取右侧颊部病变最明显处，局麻后漱口，用尖刀切取颊黏膜组织约8 mm×8 mm大小，达黏膜下层，一分为二，一份放入RNase-Free Water中漂洗血液及唾液后，置入装有1 ml RNA保存液的冻存管内，转存于-80 ℃冰箱；另一份标本送病理诊断。正常组织取自颌骨骨折固定术需行前庭沟切口者。

1.7 实时荧光定量PCR检测颊黏膜组织中wnt1水平

取颊黏膜组织加入Trizol进行总RNA的提取，取RNA提取液紫外分光光度计测定A260和A280，60份组织标本A260/A280均为1.8～2.0之间，符合要求。进行RNA反转录，内参对照采用β-actin，根据GenBank检索目的基因核苷酸序列，利用Primer Premier 5.0软件设计上下游引物，引物合成委托上海生工有限公司完成。目的基因及内参基因引物序列如下：

wnt1-F: 5'-GGGGTATTGTGAACGTAGCCT-3'

wnt1-R: 5'-CGGATTTTGGCGTATCAGA -3'

β-actin-F： 5'-CATCCTGCGTCTGGACCTGG-3'

β-actin-R: 5'-TAATGTCACGCACGATTTCC-3'

PCR反应体系：SYBR Green PCR Master Mix 15 μl,F-Primer(10 μmol/L)0.5 μl, R-Primer (10 μmol/L) 0.5 μl，PCR H2O 13 μl，cDNA 1 μl。每个样本3 个复孔，反应条件：95 ℃10 min预变性，95 ℃15 s、60 ℃ 1 min扩增40 个循环，获得各样本待测基因的CT值。wnt1及β-actin PCR扩增曲线图分别见图1～2。

图 1 wnt1扩增曲线

图 2 β-actin扩增曲线

1.8 统计学分析

经SPSS 19.0分析，PCR结果采用2-ΔCt法，采用比较Ct法以β-actin为内参对照相对定量wnt1基因的表达水平，取3次实验平均值。组间基线资料采用pearson卡方检验，其余资料比较采用t检验，相关分析采用spearman分析，Plt;0.05有统计学意义。

2 结 果

OSF组与正常组wnt1表达水平比较(表 1)。OSF组治疗前后刺激痛、张口度、唾液及龈沟液中wnt1水平比较(表 2)。OSF组 wnt1表达水平与临床指标spearman相关分析(表 3)。

表 1 OSF组及正常对照组wnt1表达水平比较

表 2 OSF组治疗前后临床指标、唾液及龈沟液中wnt1浓度差异比较

表 3 OSF临床指标与wnt1表达水平相关分析

注： ①Plt;0.05

3 讨 论

资料表明，wnt/β-catenin信号通路在组织纤维化进程中起到重要作用。体外实验证实，wnt蛋白可以诱导上皮细胞增殖、肌成纤维细胞活化增殖以及增加胶原合成[5]。He等[6]在阻塞性肾损伤模型中发现肾小管上皮细胞β-catenin表达显著增多，wnt/β-catenin信号通路活化，LEF1和纤维连接蛋白表达增强，而运用该通路拮抗剂DKK1后，β-catenin显著减少且wnt/β-catenin靶基因被抑制，同时，DKK1抑制了肌成纤维细胞的活化，胶原蛋白Ⅰ及纤连蛋白表达下调，导致阻塞肾模型中胶原纤维总量下降。

本研究发现，wnt1在OSF颊黏膜、唾液及龈沟液中的表达明显高于正常组(Plt;0.05)，表明wnt1在OSF中处于异常高表达状态，可能提示wnt/β-catenin信号通路在OSF中异常活化，并可能在OSF发生及胶原代谢中起到了一定作用。Akhmetshina等[7]发现纤维化组织中wnt1、wnt10b表达上调，在培养成纤维细胞中加入wnt1，转录因子Colla2表达明显上升且随wnt1浓度升高而上调，Colla2是指前胶原α2(I)，I型前胶原由2条αl(I)链和1条α2(I)链组成，是纤维化形成中细胞外基质的主要成分，说明wnt1可能为主要的促纤维化因子，同时wnt1显著提高了α-SMA、胶原蛋白和mRNA水平，表明wnt1可促进成纤维细胞向肌成纤维细胞转化和胶原纤维沉积，且其作用可被DKK1阻断，进一步证实wnt1在胶原形成中扮演着重要作用。

唾液和龈沟液蛋白成分主要来自血清及口腔局部黏膜上皮，与机体和局部微环境中免疫炎性状态的改变有关[8-9]，目前关于OSF唾液与龈沟液蛋白定量检测的报道甚少。随着OSF疾病的进展，患者口腔黏膜以及牙龈发生纤维化等免疫炎性改变，我们推测，其唾液和龈沟液成分也发生相应的改变，且随着治疗的深入及临床症状的改善，也会有一定的变化。实验表明，OSF患者经治疗后唾液与龈沟液中wnt1浓度均明显降低(Plt;0.01)，并且下降趋势与OSF临床指标张口度和VAS的改善呈正相关，一方面肯定了曲安奈德和丹参治疗OSF的效果，另一方面也表明wnt1与OSF的发生发展相关，同时表明唾液和龈沟液中wnt1表达水平有可能反映了OSF疾病的严重程度，为OSF的疾病诊断和监测提供一个新的思路，进一步证实可通过检测治疗前后OSF黏膜组织的DNA或RNA、western blot或免疫组化等方法提供更有力的理论依据。

曲安奈德是一种抗炎及免疫抑制作用强大的糖皮质激素药物，现已广泛应用于硬皮病、肺间质纤维化、皮肤瘢痕等纤维化疾病的治疗，可降低OSF的免疫炎性反应，促进变性的胶原纤维降解。Almeida等[10]研究发现地塞米松可通过抑制丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，从而降低wnt3a和β-catenin的表达。丹参作为一种活血化瘀药物，能改善微循环障碍。吴颖芳[11]应用丹参联合小剂量泼尼松龙治疗OSF，取得了良好疗效；左雯鑫等[12]应用复方丹参滴丸联合曲安奈德治疗OSF患者后病情改善。本研究观察到40例OSF患者经曲安奈德联合丹参治疗后，唾液及龈沟液中wnt1表达均下降，同时，口腔黏膜疼痛程度亦下降，张口度增加，提示wnt1与OSF的发生发展及临床严重程度相关。

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(收稿： 2016-10-16 修回： 2016-11-19)

Theexpressionofwnt1inoralsubmucousfibrosis

QIUXili1,XUChunjiao2,WANGLu3,LVFengyuan3,LIUTingting3,ZHOUMeilu3,XUWenhua3,WUYingfang2,FANGChangyun2,PENGJieying2.

1. 410008Changsha,XiangyaStomatologicalHospital,CentralSouthUniversity,China; 2.CenterofStomatology,XiangyaHospital,CentralSouthUniversity，Changsha； 3.SchoolofStomatology,CentralSouthUniversity,Changsha

Objective: To observe the expression of wnt1 in patients with oral submucous fibrosis(OSF) before and after treatment.Methods40 patients with OSF were treated with triamcinolone acetonide combined with salvia miltiorrhiza, Before and after 4 weeks treatment, pain score of VAS and mouth opening(MO) were examined. wnt1 protein in saliva and gingival crevicular fluid(GCF) was examined by ELISA, wnt1 mRNA expression in buccal mucosa tissue was examined by real-time fluorescent quantitative PCR. 20 healthy subjects were served as the controls.ResultsThe expression of wnt1 in OSF group[buccal tissue RT-PCR (36.89±10.40)×10-5,saliva ELISA (61.61±4.45) ng/L，GCF ELISA (56.20±3.65) ng/L] were significantly higher than that of control group[buccal tissue RT-PCR (4.63±1.53)×10-5，saliva ELISA (40.26±3.00) ng/L，GCF ELISA (53.45±1.74) ng/L)](Plt;0.01). In OSF group，after treatment VAS was decreased(Plt;0.01), MO increased(Plt;0.01)), Buccal mucosa wnt1 mRNA level was positively correlated with wnt1 protein in saliva and GCF, negativity with MO(Plt;0.05), saliva wnt1 was positively correlated with VAS and GCF wnt1, negitively with MO(Plt;0.05).ConclusionWnt1 might take part in the occurrence and development of OSF. The detection of wnt1 in saliva and GCF might be a noninvasive method for the evaluation of OSF treatment.

Oralsubmucousfibrosis(OSF);Wnt1;Wnt/β-cateninsignalingpathway

教育部留学回国人员科研启动基金(编号： 教外司留【2012】940)； 湖南省科技计划项目(编号： S2014FJ3152)

410008 长沙， 中南大学湘雅口腔医院(邱喜丽)； 中南大学湘雅医院口腔医学中心(许春姣 吴颖芳 方厂云 彭解英)； 中南大学口腔医学院(王璐 吕逢源 刘婷婷 周美璐 徐文华)

许春姣 0731-84327495 E-mail: chunjiaoxu @126.com

R781.5

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.02.017