邓智元 唐瞻贵 王月红 李毅萍

临床医学研究

口腔疣状癌中LRIG1的表达及其抑癌作用的初步研究

邓智元 唐瞻贵 王月红 李毅萍

目的探讨富含亮氨酸重复序列和免疫球蛋白样多肽 1(LRIG1)在口腔疣状癌中的表达及其抑癌作用的机制。方法收集口腔疣状癌(n=15)、口腔鳞状细胞癌(n=30)及对应癌旁组织石蜡标本共90 例，以15 例外伤患者的正常黏膜组织作为对照；免疫组织化学染色技术(SP法)检测其中LRIG1和Bcl-2的表达，并用皮尔森分析二者相关性。结果LRIG1在正常黏膜、口腔疣状癌、口腔鳞状细胞癌组织中的表达依次下降(Plt;0.05)并伴随Bcl-2的表达依次升高(Plt;0.05) ；并且，LRIG1与Bcl-2表达呈负相关。结论LRIG1可能通过抑制Bcl-2的表达抑制口腔疣状癌的发生发展。

口腔疣状癌； LRIG1； Bcl-2； 凋亡

1948 年口腔疣状癌(oral verrucous carcinoma,OVC)作为一种低度恶性且生物学行为不具备转移性的口腔黏膜鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)亚型首次被提出并获得越来越多的关注和研究[1-2]。既往的经验表明唇部和颊部是疣状癌的高发部位，除此之外也见于舌、口底、咽喉、食道、鼻腔、鼻旁窦、外生殖器器和皮肤等[3]。目前OVC的治疗方法主要有手术、化疗、放疗或者联合治疗，虽然预后良好，但复发率较高[4]。60 岁左右的吸烟男性是其高发群体，其致病机理主要与咀嚼烟草、槟榔和感染人乳头状瘤病毒(human papilloma virus，HPV)有关，且VEGF、E-cadherin和MDM2等基因在OVC的发生发展中起着重要的作用[5-8]。尽管很多学者致力于OVC的研究，但是其具体发病机制尚未完全清楚。

富含亮氨酸重复序列和免疫球蛋白样多肽-1(leuncine- rich repeats and immunoglobulin- like domains protein 1, LRIG1)基因为一种细胞表面跨膜糖蛋白，广泛存在于人体的各组织中[9-10]。它在多种肿瘤细胞中异常表达，在多种因素的影响下具有抑制肿瘤发生发展的作用[11-13]。甚至，可能通过增强受体泛素化和加速细胞内降解负反馈调节受体酪氨酸激酶的多条信号通路，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表达，促进肿瘤细胞凋亡，从而抑制肿瘤细胞生长[14-15]。本研究运用免疫组化法检测LRIG1在OVC中的表达，并对其促凋亡作用进行初步研究。

1 材料与方法

1.1 一般资料

收集1996～2014 年间于中南大学湘雅医院口腔病理科确诊并保存完好的正常口腔黏膜(normal mucosal tissue，NM)、口腔疣状癌(OVC)和口腔鳞癌(OSCC)石蜡标本及临床资料共90 例，其中OVC及其癌旁组织各15 例、OSCC 及癌旁组织各30 例。OSCC组织标本均为高分化鳞癌组织,来源于男性患者26 例，女性4 例，其平均年龄(57±9.3) 岁，且均为原发于口腔的初诊癌症患者。OVC组中，男性11 例，女性4 例，平均年龄(54±11.3) 岁，也均为原发于口腔的初诊病例。另外，经由患者及其家属同意，采集15 例颌面部外伤患者的口腔黏膜标本固定、包埋，作为对照，其中，男性6 例，女性9 例，平均年龄(35±13.3) 岁。

1.2 试剂耗材

鼠抗人Bcl-2单克隆抗体 (cell signaling technology, USA);兔抗人LRIG1多克隆抗体 (Abcam, UK);山羊血清、SP法免疫组化试剂盒(包括3%过氧化氢水，生物素标记IgG二抗和抗生物素-亲和素-过氧化物酶试剂、PBS缓冲液、DAB显色试剂(OriGene Technologies, Inc., USA)。

1.3 免疫组化染色

切片厚度每张约4 μm，置于60 ℃恒温箱2.5 h，然后按照常规脱蜡、水化；在0.01 mol/L柠檬酸缓冲溶液(pH值6.0)高压水浴煮90 s； 3%过氧化氢37 ℃恒温20 min去除内源性过氧化物酶；10%正常山羊血清37 ℃恒温1 h封闭非特异性抗原；一抗4 ℃孵育过夜；生物素标记IgG二抗和抗生物素-亲和素-过氧化物酶试剂孵育切片；DAB显色；苏木素复染；阴性对照以PBS缓冲液冲洗代替一抗。

1.4 染色结果判定

每张切片用Aperio ScanScope CS 扫描(Leica Microsystems, Inc., Buffalo Grove, IL, USA)，减少背景影响；运用配套的Aperio Quantification software version 9.1软件量化核、膜或总表达水平[16]。选择性量化上皮细胞和癌变区域。核和膜染色的表达分数(3+ 、2+、 1+，分别表示强、中、弱阳性染色)按阳性细胞的百分比使用以下公式计算: (3+)×3+(2+)×2+(1+)×1。总量化的表达分数被列为总强度或总细胞数[17]。Aperio通过扫描阳性细胞设置阈值提供的对照标准[17-19]。

1.5 统计学分析

2 结 果

2.1 LRIG1的表达

LRIG1在OVC组织中表达降低。LRIG1主要表达在各组织的细胞膜和细胞质中；通过量化免疫组化染色强度，我们发现LRIG1在NM中表达显著高于OVC和OSCC(图 1)。此外，LRIG1在OVC和OSCC中表达水平较癌旁组织显著降低；而且LRIG1在OVC中表达低于NM，但高于OSCC组织。

2.2 Bcl-2的表达

Bcl-2在OVC组织中表达升高。Bcl-2主要表达于OVC和OSCC的细胞质中，而在正常口腔黏膜中表达缺失；Bcl-2在NM中表达相对于OVC和OSCC显著减少；此外，Bcl-2在OVC和OSCC中表达水平显著高于癌旁组织(图 2)。

2.3 LRIG1与Bcl-2的相关性

在NM、 OVC和OSCC中LRIG1与Bcl-2的表达呈显著负相关。

3 讨 论

口腔疣状癌作为一种恶性程度低于口腔鳞状细胞癌的特殊亚型，“推进缘”是其病理学特征。本研究中LRIG1在口腔疣状癌和口腔鳞癌中均低表达，这与国内外文献报道LRIG1在许多肿瘤细胞中表达降低, 如胶质瘤、肺癌、直肠癌等相吻合[11-13]。且LRIG1在OVC中的表达高于OSCC，说明LRIG1的下降水平与肿瘤的恶性程度具有相关性。闫尧等[20]应用RT-PCR的方法分析了36 例食管鳞状细胞癌患者的癌组织、癌旁组织和远癌组织中LRIG1mRNA的表达情况，结果显示36 例癌组织中有15 例阳性表达，21 例LRIG1表达缺失，其阳性表达率低于相应的癌旁组织和远癌组织。LRIG1基因位于人染色体3pl4.3位点，可编码跨膜糖蛋白，该区域在人类的许多恶性肿瘤细胞中往往是缺失的[21]。且本研究中LRIG1在正常口腔黏膜、口腔疣状癌和口腔鳞癌中表达依次降低，LRIG1基因被抑制或者LRIG1基因的缺失，导致其在肿瘤组织中处于低表达或表达缺失，削弱了LRIG1促进肿瘤细胞凋亡的能力，并可能直接或间接影响上皮细胞维持稳定的能力，从而导致正常上皮细胞转化为癌变细胞[22]。Nizlsson[23]和Hedman等[24]采用RT-qPCR和western-blot(蛋白质印迹技术)方法分析了LRIGl mRNA和蛋白在多种上皮源性肿瘤细胞中的表达，发现肿瘤细胞中LRIGI的表达水平缺失或明显降低。同时相关的研究显示LRIG1的过表达具有诱导胶质瘤细胞週亡的作用[15]。这些提示LRIG1基因可能是一种抑癌基因并参与了肿瘤的发生发展。

A： 正常黏膜； B： 口腔疣状癌癌旁； C： 口腔疣状癌； D： 口腔鳞癌癌旁； E： 口腔鳞癌； F： 组间比较

图 1 LRIG1在NM、 OVC和OSCC中的表达(免疫组化， ×400)

A： NM； B： Para-OVC； C： OVC； D： Para-OSCC； E： OSCC tissues； F： Comparison between groups

Fig 1 LRIG1 expression in human NM, OVC and OSCC tissues(IHC， ×400)

A： 正常黏膜； B： 口腔疣状癌癌旁； C： 口腔疣状癌； D： 口腔鳞癌癌旁； E： 口腔鳞癌； F： 组间比较

图 2 Bcl-2在NM、 OVC和OSCC中的表达(免疫组化，×400)

A： NM； B： Para-OVC； C： OVC； D： Para-OSCC； E： OSCC tissues； F： Comparison between groups

Fig 2 Bcl-2 expression in human NM, OVC and OSCC tissues(IHC, ×400)

图 3 在NM、 OVC和OSCC中LRIG1与Bcl-2的相关性

Fig 3 The correlation between LRIG1 and Bcl 2 in NM, OVC and OSCC

Bcl-2又称B淋巴细胞瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/ leuke- mia-2)基因，该基因及表达蛋白可抑制多种组织细胞的凋亡和延长细胞寿命，所以称为凋亡抑制基因。LRIG1在NM、OVC、OSCC组织中的表达依次下降并伴随Bcl-2的表达依次升高，LRIG1与Bcl-2呈显著负相关。LRIG1在NM组织的高表达增强了对抗凋亡基因Bcl-2的抑制作用，抑制了肿瘤的形成[25]。LRIG1为受体酪氨酸激酶ErbB家族的抑制剂，其抑制ErbB受体功能的作用机制在于LRIG1介导的受体泛素化及受体退化[15]。研究表明，过表达U251胶质母细胞瘤细胞中LRIG1将下调EGFR及Bcl-2的表达水平，从而增加化疗药物敏感性，发挥抑制肿瘤生长的作用[26-27]。

综上所述，LRIG1在口腔疣状癌中低表达，其表达高低与癌症恶性度密切相关，但其具体机制有待进一步研究。而且，LRIG1与Bcl-2表达显著负相关，提示LRIG1可能通过降低Bcl-2的抗凋亡作用，促进肿瘤细胞的凋亡或抑制肿瘤细胞的增殖，发挥抑癌作用，但其具体机制需要进一步研究。

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(收稿： 2016-10-31 修回： 2016-12-12)

LRIG1expressionanditspossiblesuppressorroleinoralverrucouscarcinoma

DENGZhiyuan1,TANGZhangui1,WANGYuehong2,LIYiping3.

1. 410008Changsha,DepartmentofOralandMaxillofacialSurgery, 2.DepartmentofOralProsthodontics, 3.DepartmentofOralImplantSurgery,theXiangYaStomatologicalHospitalCentralSouthUniversity,China

Objective: To explore leuncine- rich repeats and immunoglobulin- like domains protein 1(LRIG1) expression in oral verrucous carcinoma(OVC) and its possible mechanism of tumor suppression.MethodsParaffin specimens of OVC(n=15) and oral squamous cell carcinoma(OSCC，n=30) and corresponding adjacent normal tissues, and 15 normal mucosa tissues(NM) as control from injured patients were collected. The expression levels of LRIG1 and Bcl-2 were examined using immunohistochemical SP method. The correlation between the expression levels of LRIG1 and Bcl-2 was determined using two tailed Pearson's correlation.ResultsLRIG1 was significantly lower in OVC tissue than that in NM tissue, but higher than in OSCC tissue.The expression levels of Bcl-2 in OVC were significantly higher than that in NM, but lower than in OSCC. The expression level of LRIG1 was negatively correlated with expression level of Bcl-2 in NM, OVC and OSCC tissue.ConclusionLRIG1 may inhibit the expression of Bcl-2 and the development of OVC.

Oralverrucouscarcinoma(OVC)；LRIG1；Bcl-2；Apoptosis

国家自然科学基金面上项目(编号： 81671003);中南大学中央高校基本科研业务费专项资金(编号： 2016zzts117)

410008 长沙， 中南大学湘雅口腔医院口腔颌面外科(邓智元 唐瞻贵)， 口腔种植科(王月红)， 口腔修复科(李毅萍)

唐瞻贵 E-mail: tangzhangui@aliyun.com

R739.8

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.02.009