林颖 邢泉 高现灵 徐萌 林正梅

基础医学研究

Sema3A/Nrp1信号轴在慢性牙周炎牙周组织中的表达及在牙周骨质破坏中的作用

林颖 邢泉 高现灵 徐萌 林正梅

目的研究轴突导向蛋白3A(semaphorins3A, Sema3A)及其受体神经纤毛蛋白-1(neuropilin-1, Nrp1)在慢性牙周炎发生发展中的作用。方法20 只SD大鼠随机分为2 组(n=10)，实验组建立慢性牙周炎模型，对照组常规饲养，8 周后处死。micro-CT测量大鼠釉牙骨质界到牙槽嵴顶距离(CEJ-ABC)，免疫组化染色计算Sema3A/Nrp1阳性染色积分光密度，并进行相关性分析。门诊收集慢性牙周炎样本及正常样本各10 例，进行免疫荧光和qRT-PCR检测。结果实验组釉CEJ-ABC明显高于对照组(Plt;0.05)，Sema3A/Nrp表达强度明显低于对照组(Plt;0.05)，CEJ-ABC与Sema3A/NrP呈负相关(Plt;0.05)。人牙周炎样本Sema3A/Nrp1荧光强度及mRNA相对表达量均低于对照组(Plt;0.05)。结论Sema3A/Nrp1表达量的减少参与了慢性牙周炎骨破坏进程。

】 慢性牙周炎(CP)； 骨质破坏； Sema3A/Nrp1信号轴

慢性牙周炎(chronic periodontitis, CP)是颌骨最常见的炎症性骨吸收疾病之一，也是造成失牙的主要病因之一。临床上多采用牙周洁治及刮治去除牙周袋内的感染物质，以促进牙周组织的恢复,但大量研究表明，经过彻底的牙周治疗后仍有部分患者的牙槽骨水平难以达到令人满意的愈合效果，面临牙拔除的可能。近年来有研究发现，轴突导向蛋白3A(semaphorins3A, Sema3A)/受体神经纤毛蛋白-1(neuropilin-1, Nrp1)信号轴是一对不仅能抑制破骨细胞分化，而且能促进成骨细胞分化成熟的双重调节因子，有可能成为一种新的治疗靶标[1]。越来越多的研究结果表明，Sema3A/Nrp1信号轴在促进骨形成中具有重要作用[2-3]。

然而，Sema3A/Nrp1在炎性骨吸收条件下的表达规律及作用目前尚未深入探究，因此本研究拟探索Sema3A/Nrp1信号轴在慢性牙周炎发生发展中的作用，为防治慢性牙周炎骨吸收提供新的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 实验动物

从中山大学(大学城)实验动物中心[SCXK(粤)2011-0029]购买7～8 周龄的雄性SD大鼠20 只，并在中山大学(北校区)实验动物中心[SYXK(粤)2012-0081]进行实验。本实验已获中山大学光华口腔医学院伦理委员会批准。

1.2 临床样本

1.3 主要试剂和仪器

Micro-CT扫描仪(Scanco,瑞士)；兔抗大鼠/人Sema3A多克隆抗体、兔抗大鼠/人Nrp1单克隆抗体(Abcam,英国)；TRAP染色试剂盒(Sigma,美国)；组织mRNA提取试剂盒、逆转录试剂盒(Takara，日本)；SYBR Green I，全自动反转录聚合酶链反应仪(Roche,美国)；DAPI(Thermo fisher,美国)；全自动倒置荧光显微镜(Zeiss,德国)。

1.4 动物分组及建模

将20 只SD大鼠随机分为2 组，每组10 只。实验组大鼠2%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射麻醉后，分别在双侧上颌第二磨牙龈沟处绑线结扎(5-0丝线)，并辅以高糖饮食[4]。对照组常规饲养。8 周后脱颈处死各组大鼠，分离上颌骨组织用于Micro-CT分析及病理学分析。

1.5 Micro-CT扫描

已分离的大鼠上颌骨样本立即固定在4%多聚甲醛中，48 h后转移样本进行Micro-CT扫描。扫描参数如下：电压70 kV，电流114 mA，精度20 μm，扫描时间3 000 ms。并进行3D重建，测量上颌第二磨牙颊侧近中、近中、腭侧近中及颊侧远中、远中、腭侧远中6 个位点的釉牙骨质界到牙槽嵴顶(cementoenamel junction to alveolar bone crest, CEJ-ABC)的距离，并取均值代表该样本的骨吸收程度。

1.6 苏木素-伊红染色

4)注意作为修正标记语的well，如果well处于话轮的中间，则为自己修正标记语；而处于话轮开始时，则为他人修正标记语。

Micro-CT扫描后，将大鼠上颌骨样本放置在10% EDTA二钠溶液中脱钙至少2 个月。脱钙结束后，样本被制备成8 mm×6 mm×4 mm的方块进行脱水及包埋。沿磨牙近远中方向将蜡块切成4 mm厚度的连续切片并进行HE染色。由2 位独立的病理医师在25 倍及100 倍光镜下对各组大鼠牙周情况进行评估。

1.7 免疫组化染色

每个样本选取2 张连续切片按免疫组化步骤进行染色，其中Sema3A/Nrp1抗体的使用浓度均为1∶500。染色结束后由2 位独立的病理医师在400 倍光镜下随机选取5 个视野，Image Pro Plus软件评估大鼠牙周区域Sema3A/Nrp1阳性染色的积分光密度(integrated optical density, IOD)。

1.8 免疫荧光染色

收集到的新鲜组织样本立即固定在4%多聚甲醛中，48 h后进行脱水及包埋。包埋结束后将蜡块切成4 mm厚度的连续切片，选取其中一张切片进行双标免疫荧光染色，其中Sema3A/Nrp1抗体的使用浓度均为1∶100，红色荧光标记的驴抗兔IgG作为Sema3A第二抗体，绿色荧光标记的山羊抗兔IgG作为Nrp1第二抗体，蓝色荧光标记的DAPI作为染核试剂。染色后由2 位独立的病理医师在400 倍倒置荧光显微镜下对各组Sema3A/Nrp1的表达及定位情况进行评估。

1.9 实时荧光定量PCR

收集新鲜组织样本在液氮中速冻，置于研钵中研磨。提取总RNA，测定RNA纯度及浓度。取1 μg RNA逆转录为cDNA模板，荧光定量检测组织中相对mRNA含量。引物序列见表 1。反应程序：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性10 s，65 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，反应循环40 次，每个样本设置3 个复孔，采用2-△△Ct法计算结果。

表 1 实时荧光定量PCR引物

1.10 统计学处理方法

2 结 果

2.1 SD大鼠牙周炎模型建立

建模8 周后，实验组大鼠上颌第二磨牙牙龈明显红肿、探诊易出血，龈沟加深， 已出现显著的牙周炎症状。实验组较对照组沟内上皮及结合上皮增生程度增加，胶原纤维破坏，浆细胞浸润，牙槽骨轻度吸收；对照组临床及病理检查牙周组织无明显异常(图 1)。Micro-CT三维重建结果显示实验组釉牙骨质界到牙槽嵴顶的平均距离达0.87 mm，对照组为0.61 mm，二者差异有统计学意义(图 2,表 2)。

图 1 苏木素-伊红染色结果

图 2 Micro-CT三维重建显示釉牙骨质界到牙槽嵴顶距离

Fig 2 Micro-CT results showing the CEJ-ABC distance

2.2 Sema3A/Nrp1表达检测

实验组及对照组Sema3A/Nrp1阳性染色结果及IOD值见图 3。与对照组相比，实验组Sema3A/Nrp1 IOD值均显著下降，且两组差异具有统计学意义(Plt;0.05)，提示在牙周炎发生发展过程中Sema3A/Nrp1的表达水平下调(图 3)。

2.3 相关性分析

应用统计方法对各组釉牙骨质界到牙槽嵴顶距离与Sema3A/Nrp1的IOD值进行相关性分析，表 2显示二者呈明显的负相关关系，提示Sema3A/Nrp1信号轴的表达水平与骨吸收密切相关。同时，Sema3A与其受体Nrp1的表达水平间也具有明显的正相关关系。

表 2 Sema3A/Nrp1染色IOD值与CEJ-ABC的关系

2.4 临床样本Sema3A/Nrp1定性、定位、定量表达情况

实验组及对照组免疫荧光染色结果见图 4。其中蓝色荧光代表细胞核的表达情况，红色荧光代表Sema3A+的表达情况，绿色荧光代表Nrp1+的表达情况。荧光染色合成图显示Sema3A蛋白主要在胞质及胞膜表达，Nrp1蛋白主要在胞膜表达。与正常对照组相比，实验组Sema3A/Nrp1信号轴的表达强度及密度显著降低(Plt;0.05)。与对照组相比，实验组Sema3A/Nrp1的mRNA相对表达量明显降低(Plt;0.05)(图 5)。

图 3 免疫组化染色结果(×400)

Fig 3 IHC staining results(×400)

图 4 免疫荧光染色结果(×400)

Fig 4 IF staining results(×400)

图 5 Sema3A/Nrp1 mRNA相对表达量

3 讨 论

慢性牙周炎是因牙周组织感染厌氧菌或兼性厌氧菌而导致牙骨质、牙周膜、牙槽骨等结构持续性破坏的一种炎性疾病。由于细菌致病因子的存在及成骨细胞、破骨细胞活性的失衡，单纯采取抑制破骨细胞分化或促进成骨细胞分化的方法都难以使牙周骨质达到最理想的愈合效果[5-7]。Sema3A/Nrp1作为一对骨双重调节因子，在促进骨形成方面的作用越来越受重视[8]。国内外研究结果表明，Sema3A的表达水平在类风湿性关节炎中下调，并与疾病的活跃度及病理表现相关[9]，同时Sema3A可以减缓实验性自身免疫性关节炎的炎症进展情况[10]。本研究率先探索了Sema3A/Nrp1信号轴在慢性牙周炎发生发展中的作用，结果发现与正常牙周组织相比，炎性牙周组织中Sema3A/Nrp1信号轴的表达显著下调，进一步证实了炎症环境下Sema3A的表达水平受到了抑制。同时本研究通过对Sema3A/Nrp1信号轴的表达水平与牙周骨质破坏程度进行相关性分析，发现二者呈显著的负相关关系。因此我们有理由相信，下调的Sema3A/Nrp1信号轴其抑制破骨前体细胞迁移、分化以及促进成骨细胞分化的能力也受到抑制，造成了牙槽骨的破坏性吸收。未来如果针对Sema3A/Nrp1信号轴进行靶向干预，有可能显著促进牙周骨质破坏的恢复。

本研究通过对Sema3A/Nrp1信号轴在大鼠及人牙周组织样本中的表达进行检测，进一步明确了它的时空表达规律。Sema3A作为Semaphorins家族中的分泌性蛋白，主要在胞质及胞膜表达，但其必须与Plexin-A1及Nrp1复合受体结合后才能协同向胞内转导信号，从而发挥作用。然而正是由于其受体Plexin-A1及Nrp1既在破骨细胞前体细胞和破骨细胞胞膜表面表达，又在成骨细胞胞膜表面表达，因此决定了Sema3A作为骨双重调节因子的分子基础[11]。通过对Sema3A及其受体Nrp1表达水平的相关性分析，我们发现二者具有明显的正相关性(rS-N=0.977，Plt;0.05)，进一步证实了二者作为一对骨调节信号轴蛋白的协同关系。

慢性牙周炎导致的骨质吸收，是由于病原微生物刺激而导致牙周组织抗感染免疫反应的结果。在牙周炎的病理变化过程中，其致病菌牙龈卟啉单胞菌的内毒素脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)发挥了重要的致病作用[12-13]。LPS可以促进炎性因子如TNF-α、IL-1等的表达，从而促进破骨前体细胞的成熟[14-15]。因此我们推测LPS可能是影响Sema3A/Nrp1信号轴表达下调的重要因素，该部分内容还需要进一步深入研究。

总之，通过建立大鼠根尖周炎模型及对人临床样本的检测，证实Sema3A/Nrp1在慢性牙周炎中表达下降，并与牙槽骨的骨质缺损密切相关，为慢性牙周炎等炎症性骨吸收的病理研究和治疗提供新的思路和依据。

[1] Hayashi M, Nakashima T, Taniguchi M, et al. Osteoprotection by semaphorin 3A[J]. Nature, 2012,485(7396): 69-74.

[2] Shen WW, Chen WG, Liu FZ, et al. Breast cancer cells promote osteoblastic differentiation via Sema 3A signaling pathwayinvitro[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2015, 8(2): 1584-1593.

[3] Li Y, Yang L, He S, et al. The effect of semaphorin 3A on fracture healing in osteoporotic rats[J]. J Orthop Sci, 2015,20(6): 1114-1121.

[4] 王月昊, 王小琴, 苗伟，等. 间歇性低氧对牙周炎大鼠牙周组织中NF-κB、IL-6及PGE2含量的影响[J]. 实用口腔医学杂志,2016,32(1):28-31.

[5] Lewiecki EM. New targets for intervention in the treatment of postmenopausal osteoporosis[J]. Nat Rev Rheumatol, 2011,7(11): 631-638.

[6] Rachner TD, Khosla S, Hofbauer LC. Osteoporosis: now and the future[J]. Lancet, 2011,377(9773): 1276-1287.

[7] Reid IR, Miller PD, Brown JP, et al. Effects of denosumab on bone histomorphometry: The FREEDOM and STAND studies[J]. J Bone Miner Res, 2010,25(10): 2256-2265.

[8] Kang S, Kumanogoh A. Semaphorins in bone development, homeostasis, and disease[J]. Semin Cell Dev Biol, 2013,24(3): 163-171.

[9] Takagawa S, Nakamura F, Kumagai K, et al. Decreased semaphorin3A expression correlates with disease activity and histological features of rheumatoid arthritis[J]. BMC Musculoskelet Disord, 2013,14:40.

[10]Catalano A. The neuroimmune semaphoring-3A reduces inflammation and progression of experimental autoimmune arthritis[J]. J Immunol， 2010, 185(10):6373-6383.

[11]Suzuki K, Kumanogoh A, Kikutani H. Semaphorins and their receptors in immune cell interactions[J]. Nat Immunol, 2008,9(1): 17-23.

[12]Kikuchi T, Matsuguchi T, Tsuboi N， et al. Gene expression of osteoclast differentiation factor is induced by lipopolysaccharide in mouse osteoblasts via Toll-like receptors[J]. J Immunol,2001, 166(5):3574-3579.

[13]Gao Y, Grassi F, Ryan MR， et al. IFN-gamma stimulates osteoclast formation and bone lossinvivovia antigen-driven T cell activation[J]. J Clin Invest,2007, 117(1):122-132.

[14]Xing Q, de Vos P, Faas MM， et al. LPS promotes pre-osteoclast activity by up-regulating CXCR4 via TLR-4[J]. J Dent Res,2011, 90(2): 157-162.

[15]Kikuchi T, Matsuguchi T, Tsuboi N， et al. Gene expression of osteoclast differentiation factor is induced by lipopolysaccharide in mouse osteoblasts via Toll-like receptors[J]. J Immunol,2001, 166(5):3574-3579.

(收稿： 2016-12-27 修回： 2017-02-15)

TheexpressionofSema3a/Nrp1signalaxisintheperiodontaltissuewithchronicperiodontitisandit'sroleinbonedestruction

LINYing,XINGQuan,GAOXianling,XUMeng,LINZhengmei.

510055Guangzhou,GuanghuaSchoolofStomatology,HospitalofStomatology,SunYat-senUniversity,GuangdongProvincialKeyLaboratoryofStomatology,China

Objective: To explore the role of Semaphorins 3A(Sema 3A) and its receptor Neuropilin-1(Nrp1) in the development of chronic periodontitis of rats and clinical samples.Methods20 SD rats were divided into 2 groups. Rats in the experimental group were induced into chronic periodontitis models. Rats in control group were not treated. After 8 weeks, maxilla of all the rats were collected for micro-CT scanning and IHC staining. The distance from cementoenamel junction to alveolar bone crest(CEJ-ABC) and the IOD of Sema3A/Nrp1 positive staining in rats were analyzed. 20 clinical samples of chronic periodontitis(n=10) and normal periodontal tissues(n=10) were collected for immunofluorescence and qRT-PCR analysis.ResultsThe CEJ-ABC distance of chronic periodontitis group was higher than that of the control group(Plt;0.05). The IOD of Sema3A/Nrp1 in experimental group was lower than that of the control group(Plt;0.05) and with a negative correlation with bone loss(Plt;0.05). Immunofluorescence and qRT-PCR analysis showed that the expression level of Sema3a/Nrp1 in clinical samples with chronic periodontitis was also lower than that of the healthy subjects(Plt;0.05).ConclusionThe reduced Sema3A/Nrp1 plays an important role in the development of bone destruction in chronic periodontitis.

Chronicperiodontitis(CP)；Bonedestruction；Sema3a/Nrp1signalaxis

国家自然科学基金(编号： 81300874)； 广东省科技计划项目(编号： 2016B050502008)； 广东省医学科学技术研究基金(编号： A2016195)

510050 广州， 中山大学光华口腔医学院·附属口腔医院，广东省口腔医学重点实验室

林正梅 E-mail: linzhm@mail.sysu.edu.cn

R781.4

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.02.001