吴广升 惠光艳

载microRNA-148b壳聚糖/透明质酸纳米粒制备及鉴定

吴广升 惠光艳

目的制备并评价壳聚糖/透明质酸(CS/HA)纳米粒负载microRNA-148b(miR-148b)的效果。方法制备CS/HA/miR-148b纳米粒, 用激光纳米测量仪和透射电镜对其粒径、电位和形态进行观察。通过凝胶阻滞实验观察CS/HA 纳米粒对miR-148b的包载情况。用CCK-8实验评价CS/HA/miR-148b纳米粒对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs) 的细胞毒性; 转染实验和流式细胞术检测转染效率。结果CS/HA/miR-148b纳米粒呈球形，粒径为160～370 nm，电位为+15 mV～+41 mV。氮磷比为20可以达到最佳的包封效果。CS/HA/miR-148b纳米粒对大鼠MSCs无细胞毒性并且具有较高的转染效率。结论CS/HA 纳米粒可以安全有效地将miR-148b转染入MSCs中。

微小RNA； 壳聚糖； 纳米粒； 间充质干细胞(MSCs)

微小核糖核酸(MicroRNA, miRNA)是一种小的内源性非编码RNA分子，大约由21～25 个核苷酸组成。miRNA通过翻译水平抑制或促进目的mRNAs的降解而调节基因的表达，如miRNA可以调控干细胞的增殖、分化、凋亡及癌变等。miRNA 在干细胞成骨分化过程中发挥了非常重要的作用，被广泛应用于骨再生方面的研究[1-3]。然而，极易降解、细胞摄取性差及潜在的免疫源性等缺点限制了miRNA的临床应用。因此，选择合适的载体负载miRNA提高细胞转染效率是目前研究的热点。

非病毒性基因载药系统，如壳聚糖/透明质酸(chitosan/hyaluronic acid, CS/HA)纳米粒具有良好的生物相容性、生物降解性、高稳定性、低宿主免疫反应等特点，可以作为基因载体用于细胞的转染。壳聚糖(CS)是一种带高正电荷的天然高分子多糖，可以与带负电荷的基因、生长因子、 抗肿瘤药物等结合形成纳米粒。透明质酸(HA)是一种天然阴离子多糖，已经被广泛用于药物投递系统的研究。miR-148b是一种强促成骨miRNA，转染干细胞后可以高效地促进成骨相关基因的表达[4]。本实验制备CS/HA/miR-148b纳米粒并对其理化性质、细胞毒性及转染效率进行评价，为CS/HA/miR-148b纳米粒进一步应用于促进体内骨再生研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

医用级壳聚糖(脱乙酰度90%，相对分子质量100 000，金壳，浙江)，透明质酸(相对分子质量10 000，福瑞达，山东)，胎牛血清 (Hyclone，美国)，α-MEM培养液 (低糖型，Gibco，美国)，胰蛋白酶(Sigma，美国)，乙酸(优级纯，国药集团)， CO2恒温细胞培养箱 (Heraeus，德国)，倒置荧光显微镜(OLYMPUS，日本)。miR-148b (吉玛, 上海)。

1.2 方法

1.2.1 CS/HA/miR-148b纳米粒的制备 参考相关文献制备CS/HA纳米粒[5]。将适量CS溶于2%的乙酸并调整pH值至5.5， 适量HA溶于去离子水中。将CS和HA溶液过虑除菌(0.22 μm)后以1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、 7∶1的体积比混合并在磁力搅拌器上搅拌30 min(3 000 r/min)。HA浓度保持11.25 μg/ml不变，CS的浓度为:5.625、11.25、22.5、33.75、45、56.25、67.5、78.25 μg/ml。 将适量的20 μmol/L miR-148b以不同的N/P(CS的氨基与miRNA的磷酸基团的摩尔比例)加入CS/HA纳米粒体系，混匀后室温下静置30 min获得CS/HA/miR-148b。

1.2.2 CS/HA/miR-148b纳米粒的性质 通过激光纳米粒径测量仪 (Zetasizer Nano ZS90, Malvern Instruments, UK) 检测CS/HA/miR-148b纳米粒的粒径、电位。采用透射电镜(JEM-1200EX, JEOL Ltd., Japan)观察纳米粒形态。

1.2.3 凝胶电泳实验 评价CS/HA纳米粒miR-148b包封情况采用2%的琼脂糖电泳实验。将裸miR-148b及不同N/P (1∶1、 5∶1、 10∶1、 15∶1、 20∶1、 25∶1) CS/HA/miR-148b纳米粒体系加入2%琼脂糖中，电泳缓冲液为乙酸-EDTA缓冲液(pH 8.0)。在110V电压电泳20 min后凝胶成像系统下观察、拍照 (GDS-8000, UVP, USA)。

1.2.4 大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)原代培养及鉴定 参考相关文献[6]， 颈椎脱臼处死3 周龄SD大鼠后，分离股骨，剪断两端后α-MEM冲洗，离心，重悬，原代培养。参考文献[7]的方法，对第3 代MSCs进行成脂及成骨诱导及鉴定。

1.2.5 CS/HA/miR-148b纳米粒细胞毒性检测

MSCs以2×104/孔接种96 孔板中， 24 h后换液，CS/HA/miR-148b纳米粒以25、 50、 100、 200 μg/ml的浓度加入96 孔板中，对照组不含纳米粒。在孵箱内培养24 h后采用CCK-8试剂盒(七海生物，上海)进行细胞毒性检测。

1.2.6 CS/HA/miR-148b纳米粒转染效率检测 采用流式细胞仪定量检测不同浓度的CS/HA/miR-148b(miR-148b被Cy3标记)对大鼠MSCs转染效率。以 5×104/孔的密度将MSCs加入24 孔板， 24 h 后每孔加入含不同浓度的CS/HA/miR-148b纳米粒的(0、 50、 100、 150、 200 nmol/L)α-MEM培养液各0.5 ml(不含血清)。转染 4 h 后更换含10%胎牛血清的培养液继续培养 20 h。然后弃上清，PBS冲洗 2 次，1%多聚甲醛固定 30 min。通过流式细胞仪(Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA)检测MSCs中Cy3的荧光强度评价CS/HA/miR-148b转染的效率。同时将24孔板内的MSCs进行DAPI染色，倒置荧光显微镜下定性观察CS/HA/miR-148b对MSCs的转染情况。

1.3 统计分析

2 结 果

2.1 CS/HA/miR-148b纳米粒的性质

CS/HA/miR-148b纳米粒的粒径为160～370 nm，电位为+15 mV～+41 mV。CS∶HA为4∶1时纳米粒粒径最小(图 1)为160 nm，电位为+34 mV。 透射电镜观察CS/HA/miR-148b纳米粒呈球形分散分布(图 2)。

2.2 凝胶电泳实验

如图 3所示，随着CS/HA/miR-148b中N/P的比率增加， CS/HA纳米粒对miR-148b包封作用越来越明显，当N/P为20时，可以达到最佳的包封率。

图 1 CS/HA/miR-148b纳米粒的性质

图 2 透射电镜观察CS/HA/miR-148b 纳米粒形态

(A: ×10 000, B: ×40 000)

Fig 2 TEM images of CS/HA/miR-148b nanoparticles

(A: ×10 000, B: ×40 000)

图 3 凝胶电泳实验(N/P=1∶1～25∶1)

Fig 3 Gel retardation analysis of HA/CS/miR-148b nanoparticles(N/P=1∶1～25∶1)

2.3 原代培养培养MSCs及多向分化鉴定

原代培养获得大鼠MSCs，茜素红染色及油红染色证明其具有成骨及成脂多向方向分化潜能(图 4)。

2.4 CS/HA/miR-148b纳米粒细胞毒性检测

如图 5所示， 25～200 μg/ml CS/HA/miR-148b纳米粒对MSCs的增殖均未有明显抑制作用，说明 CS/HA纳米粒是一种安全的基因载体，CS/HA/miR-148b纳米粒可以用于进一步细胞转染实验。

2.5 CS/HA/miR-148b纳米粒转染效率

如图 6所示，随着CS/HA/miR-148b纳米粒浓度由50 nmol/L增加至150 nmol/L，其转染效率逐渐增高。但是，当CS/HA/miR-148b纳米粒浓度达到200 nmol/L时，其转染效率较150 nmol/L没有明显增加，说明CS/HA/miR-148b纳米粒在150 nmol/L时转染效率达到了最佳。图 7显示在150 nmol/L时，大量红色的miR-148b(Cy3标记)围绕在蓝色的MSCs核周围(DAPI染色)。

A: 茜素红染色； B: 油红O染色

图 5 HA/CS/miR-148b纳米微粒细胞毒性

*:vs0组,Plt; 0.001; #、 ##和###:vs50 nmol/L组,Plt;0.05、Plt;0.01和Plt;0.001; @:vs100 nmol/L组，Plt;0.05

图 6 不同浓度HA/CS/miR-148b纳米粒转染效率

*：vs0 group，Plt;0.001; #， ## and ###：vs50 nmol/L，Plt;0.05, 0.01 and 0.001; @：vs100 nmol/L，Plt;0.05

Fig 6 Transfection efficiency of HA/CS/miR-148b nanoparticles with various doses

图 7 荧光显微镜观察HA/CS/miR-148b纳米粒内吞情况/(150 nmol/L)

3 讨 论

细胞因子和生长因子等已经被广泛用于组织再生中，然而，蛋白质类生长因子由于内在稳定性差、成本高、半衰期短等缺点限制了其进一步的应用[8]。基因治疗提供了一种新的选择，近年来 miRNA吸引了很多学者的兴趣，因为它可以通过调控目标基因的表达广泛影响细胞功能，包括细胞的增殖、分化、凋亡及其他代谢过程[9]。miRNA在促进干细胞向成骨细胞分化，促进体内成骨方面起到了重要作用。Wu等[10]以脂质体为载体将miR-148b包载后冻干在培养板表面，发现miR-148b可以成功地转染入MSCs内并显著提高碱性磷酸酶、骨钙素、Ⅰ型胶原等成骨相关基因的表达。

基因转染技术的关键在于安全和较高的转染效率，转染载体的选择尤为重要。病毒和脂质体是最常见的转染载体，但前者在安全性上存在隐患，后者价格较贵且毒性较大，限制了它们的临床应用。因此，寻找高效、低毒且价格低廉的载体是基因转染技术发展的关键。壳聚糖由于其良好的细胞相容性、生物可降解性、无毒性、无免疫原性及抗菌活性等优点，在生物医学领域倍受关注，壳聚糖作为一种新型的非病毒载体，具有低毒、廉价等优点，是近年来基因转染载体的研究热点之一[11-12]。

本实验通过壳聚糖带正电荷的氨基与透明质酸带负电荷的羧基间凝聚形成HA /CS纳米粒，再吸附带负电荷的miR-148b从而形成 HA/CS/miR-148b纳米粒。CS∶HA为4∶1时纳米粒的粒径为160 nm，电位为+34 mV，有利于细胞的黏附和吞噬，从而顺利地将miR-148b转染入细胞内。Liu等[13]制备了油酰壳聚糖/透明质酸/质粒DNA纳米粒并利用此转染体系对Caco-2细胞系进行转染，发现此纳米粒转染体系具有低细胞毒性，高转染效率的特点。我们制备了HA/CS/miR-148b纳米粒并将其用于MSCs的转染，同样取得了低毒、高效的转染效果。

HA /CS纳米粒是一个安全、高效的miRNA载体，将HA/CS/miR-148b纳米粒用于转染干细胞并促进骨再生具有广阔的研究前景。

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(收稿： 2016-10-22 修回： 2016-11-19)

Preparationandcharacterizationofchitosan/hyaluronicacidnanoparticlesformicroRNA-148bdelivery

WUGuangsheng,HUIGuangyan.

266071,NavyQingdaoFirstSanatorium,China

Objective: To prepare and characterize chitosan/hyaluronic acid (CS/HA) nanoparticles for miRNA-148b(miR-148b) delivery.MethodsCS/HA/miR-148b nanoparticles were prepared. The particle size, zeta potential, morphology were investigated by nano laser granulometer and TEM respectively. The encapsulation efficiency of CS/HA nanoparticles was evaluated by gel retarding analysis. The cytotoxicity and transfection efficiency of CS/HA/miR-148b nanoparticles on rat bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) were evaluated by CCK-8 assay, transfection assay and FCM respectively.ResultsThe CS/HA/miR-148b nanoparticles were discrete spherical particles with the diameter of 160 to 370 nm and zeta potential of +15 to +41 mV. N/P ratio at 20∶1 of the nanoparticles showed the optimum encapsulation efficiency for miR-148b. CS/HA/miR-148b nanoparticles exhibited no cytotoxicity to MSCs and could deliver miR-148b to the MSCs at high transfection efficiency.ConclusionCS/HA/miR-148b nanoparticles are safe and effective for miR-148b delivery into MSCs.

microRNA;Chitosan;Nanoparticle;Mesenchymalstemcells(MSCs)

青岛市市南区公共领域科技支撑计划项目(编号： 2014-14-047-SW)

266071， 海军青岛第一疗养院

惠光艳 E-mail: huiguangyan1968@126.com

R783.1

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.01.007