任广明，徐黎明，赵景壮，尹家胜，卢彤岩

（中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江 哈尔滨 150070）

香菇多糖提取物体外抗IHNV的机制

任广明，徐黎明，赵景壮，尹家胜，卢彤岩

（中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江 哈尔滨 150070）

本研究以虹鳟性腺细胞（rainbowtrout gonad cell，RTG）为细胞模型，采用MTT法体外测定香菇多糖提取物的细胞毒性及其对传染性造血器官坏死病毒（IHNV）直接灭活、预防与生物合成的影响，探讨香菇多糖提取物抗IHNV的作用机制。结果显示：香菇多糖提取物对RTG细胞没有毒性作用。浓度为100μg/mL时，香菇多糖提取物对IHNV的直接灭活能力为52.48%，预防效果为50.38%，抑制IHNV生物合成的能力达84.41%。结果表明：香菇多糖提取物具有一定的抗IHNV作用，该作用主要与抑制IHNV在细胞内的生物合成有关。

香菇多糖提取物；抗IHNV；抗病毒机制

传染性造血器官坏死病（Infectious hematopoietic necrosis，IHN）是影响我国鲑鳟渔业发展最为致命的病毒性疾病，其病原为传染性造血器官坏死病病毒（Infectious hematopoietic necrosis virus，IHNV）[1,2]。该病毒一旦侵入鱼体，首先在鱼体肾脏和脾脏造血组织增殖，进入血液循环后便在鱼体各个器官中繁殖，引发鲑鳟突发性死亡[3]。近些年来，我国鲑鳟主产区多次暴发大规模的IHNV事件。2009年甘肃省某大型虹鳟养殖场稚鱼突然出现大面积死亡，死亡率约为90%[4]。2011年青海省大部分养殖场暴发IHN疫情，造成的经济损失达47.1万元。2013年吉林省与辽宁省部分养殖场虹鳟大量死亡[5,6]。2014年北京市、四川省、山东省等地陆续暴发IHN疫情。中国农业部《兽医公报》发布的中国水生动物疫病状况报告显示，2015年对10省（市）设置的253个监测场点的监测表明，阳性样品检出率平均为5.4%[7]。可见，随着水产养殖业的不断发展，IHNV对冷水鱼养殖业危害不断扩大，严重威胁健康养殖的发展。

多糖（polysaccharide）是一种天然的生物活性成分，具有调节机体免疫力、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、降血糖等作用[8]。研究表明，多糖可以激活T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞等免疫细胞参与机体免疫，尤其是可以诱导干扰素的产生、活化补体而抵抗病毒的侵袭[9]。多糖糖链中含有的模拟配体结构与病毒具有一定的相似性，能够阻断病毒与宿胞表面结合，加强细胞修复及细胞膜的稳定，抑制病原体的侵入。多糖还能够通过阻止病毒在机体内的复制起到抗病毒的作用。目前多糖在抑制和治疗肝炎病毒、带状疱疹病毒、Abelson病毒、流感病毒中都显示出诱人的应用前景[10]。本研究以RTG细胞系为细胞模型，通过不同给药方式分析香菇多糖Lentian提取物抗IHNV的能力，探索其抗IHNV机制，为香菇多糖提取物抗IHNV机制的深入研究奠定一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 香菇多糖提取物

香菇多糖提取物由东北农业大学资源与环境学院微生物系曲娟娟教授惠赠。香菇多糖提取物用双蒸水配成10mg/mL母液，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装，-20℃保存。实验时采用M199维持液稀释至所需浓度。

1.1.2 细胞与毒株

IHNV毒株HLJ-15由黑龙江水产研究所水产病害实验室分离保存。虹鳟性腺细胞（rainbowtrout gonad cell，RTG）由中国水产科学研究院长江水产研究所鱼病害研究室曾令兵教授惠赠。

1.2 方法

1.2.1 病毒滴度测定

用M199维持液10倍系列梯度稀释（10-1～10-9）HLJ-15病毒株，分别加入到生长良好的RTG细胞中（96孔板），每孔加入稀释液体100μL，每个稀释度设置6个重复孔，正常细胞（不接种病毒的细胞）为对照组。随后置于15℃、5%的CO2培养箱中培养7d，逐日观察细胞病变程度（Cytopathic effect，CPE）。培养终止后，结晶紫染色，根据Reed-Münch 公式计算病毒半数感染量（TCID50）[11]。lgTCID50=距离比×稀释度对数之差+高于50%病变率的稀释度的对数。实验重复3次。

1.2.2 香菇多糖提取物的细胞毒性测定

将不同稀释浓度的香菇多糖提取物溶液（12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、75μg/mL、100μg/mL、125μg/mL）加入到生长状态良好的RTG细胞中（96孔板），每孔加入100μL，每个稀释度设6个重复，同时设正常对照组（不加入香菇多糖提取物稀释液）和空白对照组（不接入细胞，不加入香菇多糖提取物稀释液）。18℃下5%的CO2培养箱中培养7d后取出培养板，MTT法测定细胞活性[12]。细胞存活率 =A香菇多糖组/A正常对照组×100%。

1.2.3 香菇多糖提取物抗病毒实验

1.2.3.1 香菇多糖提取物对病毒的直接灭活作用

将不同倍比稀释的香菇多糖提取物溶液与100TCID50病毒液等体积混合，15℃孵育2h后，分别加入到已培养至单层的RTG细胞（96孔板）中，每孔100μL，于15℃、5%的CO2培养箱中培养2h后，吸弃培养液换用维持液。实验同时设正常细胞组（不加入香菇多糖提取物溶液、不接病毒）、病毒对照组（不加入香菇多糖提取物溶液）与空白对照组（不接细胞、不加入香菇多糖提取物溶液、不接病毒），每组设6孔重复，15℃、5%的CO2培养箱中培养并观察CPE情况，当病毒对照组CPE达到75%以上时，记录各组CPE（CPE判定标准：记录“-”为正常细胞，“+”为 25%以上的细胞出现 CPE，“++”为50%以上的细胞出现CPE。“+++”为75%以上细胞出现CPE），并采用MTT法测定香菇多糖提取物对病毒的直接灭活作用。此实验重复3次。病毒抑制率 =（A香菇多糖组-A病毒组）/（A正常对照组-A病毒组）×100%。

1.2.3.2 香菇多糖提取物对病毒的预防作用

将不同倍比稀释的香菇多糖提取物溶液分别加入到培养至单层的96孔板RTG细胞中，每孔接入100μL，18℃培养2h后吸弃上清液，PBS清洗后，每孔分别接入100μL含100TCID50病毒悬液。同时设正常细胞组、病毒对照组与空白对照组，每组设6孔重复，15℃、5%的CO2培养箱中培养并观察CPE情况。当病毒对照组CPE达到75%以上时，记录各组CPE情况，用MTT法测定香菇多糖提取物对病毒的预防作用。此实验重复3次。

1.2.3.3 香菇多糖提取物对病毒生物合成的抑制作用

将100μL含100TCID50病毒的悬液加入到已培养至单层的96孔板RTG细胞中，15℃培养2h后吸弃病毒液，PBS清洗后，每孔分别接入100μL含有不同倍比稀释的香菇多糖提取物溶液。同时设正常细胞组、病毒对照组与空白对照组，每组设6孔重复，15℃、5%的CO2培养箱中培养并观察CPE情况。当病毒对照组CPE达到75%以上时，记录各组CPE情况，采用MTT法测定香菇多糖提取物对病毒生物合成的抑制作用。此实验重复3次。

1.3 数据处理

数据采用平均值±标准误表示，采用SPSS19.0软件包中的单因素方差分析（one-way-ANOVA），样本间行t检验（P＜0.05）。采用Probit回归分析法计算香菇多糖提取物对病毒的半数抑制浓度IC50。

2 结果与分析

2.1 病毒滴度测定

据 Reed-Münch法计算，HLJ-15病毒株的TCID50为10-7.5，即接种滴度为10-7.5的HLJ-15病毒悬液100μL可使50%的RTG细胞发生病变，本实验用病毒为100TCID50。

2.2 香菇多糖提取物对细胞的毒性

由图1可知，香菇多糖提取物浓度为12.5～125μg/mL时，RTG细胞存活率达90%以上，其对RTG细胞的增殖作用差异不显著（P＜0.05），对RTG细胞没有毒性作用。当香菇多糖浓度为100μg/mL时，细胞存活率达95%以上，此浓度即为香菇多糖作用于RTG细胞的最高安全浓度[13]。

图1 香菇多糖提取物对细胞的毒性Fig.1 The cytotoxicity of Lentinan extracts to rainbow trout gonad cell（RTG）

2.3 香菇多糖提取物的抗病毒活性

2.3.1 香菇多糖提取物对IHNV的直接灭活作用

由表1可知，不同浓度的香菇多糖提取物均具有不同程度减轻细胞病变的作用，且随着香菇多糖提取物浓度的增加，IHNV抑制率逐渐增高，表现出一定的量效关系。这一结果证明，香菇多糖提取物对IHNV具有直接灭活作用。当浓度为1.56μg/mL时，香菇多糖提取物对IHNV的抑制能力达到9.70%；浓度为100μg/mL时，香菇多糖提取物对IHNV的抑制能力提高至52.48%，其IC50为115.94μg/mL。

表1 香菇多糖提取物对IHNV毒的直接灭活作用Tab.1 Effect of Lentinan extracts on direct inactivation of IHNV

2.3.2 香菇多糖提取物对IHNV的预防作用

由表2可知，香菇多糖提取物具有不同程度的预防细胞发生病变的作用，随着香菇多糖提取物浓度的升高，其预防能力逐渐提高，呈现出一定的量效关系。浓度为1.56μg/mL时，香菇多糖提取物保护细胞免受IHNV侵染的能力为5.54%；随着香菇多糖提取物浓度的增大，其保护细胞免受IHNV侵染的能力升高44.84%，即在浓度为100μg/mL时，香菇多糖提取物保护细胞免受IHNV的侵染能力达到50.38%。回归分析可知，香菇多糖提取物的IC50为91.26μg/mL。

表2 香菇多糖提取物对IHNV的预防作用Tab.2 Effect of Lentinan extracts on prevention of IHNV

2.3.3 香菇多糖提取物对IHNV生物合成的抑制作用

由表3可知，香菇多糖提取物均具有不同程度的抑制IHNV生物合成的作用。浓度为1.56μg/mL时，香菇多糖提取物抑制IHNV生物合成的作用仅为6.10%；随着香菇多糖提取物浓度增至6.25μg/mL时，其抑制作用升高到47.80%；当浓度为100μg/mL时，香菇多糖提取物对IHNV的生物合成抑制能力达到84.41%，香菇多糖提取物的IC50为 11.57μg/mL。

表3 香菇多糖提取物对IHNV生物合成的抑制作用Tab.3 Effect of Lentinan extracts on inhibition of IHNV biosynthesis

3 讨论

IHNV属于弹状病毒科Rhabdoviridae诺拉弹状病毒属Novirhabdovirus，主要感染鲑鳟，包括虹鳟Oncorhynchus mykiss、大马哈鱼 Oncorhynchus、大西洋鲑 Salmo salar以及硬头鲑（Steelhead，Salmon Gairdneri）等[14,15]。根据鱼的种类、年龄、病毒株系以及环境条件的不同，IHN暴发可导致鲑鳟鱼苗死亡率接近100%、成鱼死亡率达到25%～30%[2]。中国已将IHN列为二类疫病[16]。

目前，我国尚无可用于防治IHN的有效药物，主要以预防为主。传统的抗生素类药物防控IHN的效果甚微，且其在鱼体残留等问题，已经被许多国家禁止使用[17]。由于致病毒株存在变异、受环境条件以及生物安全性等因素的制约，限制商品化疫苗的引入及其应用。多糖为天然活性物质，来源广泛，提取成本低，具有增强机体免疫能力、抗病毒、抗炎症、抑菌等生理功能。它能够参与生命现象中如细胞分裂、细胞识别、细胞间物质运输等重要生命过程[18]。针对多糖抗病毒的特点，研究学者已开展大量的科学研究。目前，多糖对肝炎病毒、带状疱疹病毒、Abelson病毒、流感病毒等都展现出良好的抑制效果[10]。

目前，多糖抗病毒主要应用于动物病毒、植物病毒的研究，在水产动物病毒防治的研究还鲜有报道。本研究以RTG细胞系为细胞模型研究香菇多糖提取物对IHNV所致细胞病变的抑制作用。结果表明：香菇多糖提取物对IHNV具有直接的灭活作用、预防作用及抑制病毒生物合成的作用，其中抑制病毒生物合成的作用更为显著。可见，香菇多糖提取物抑制IHNV的作用机制可能存在多种途径，抑制IHNV在细胞内生物合成是香菇多糖提取物抗IHNV活性的重要途径之一。这与已报道的钝顶螺旋藻Spirulina platensis多糖[19]抑制单纯疱疹病毒，板蓝根Isatis Root多糖[20]抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的作用机制较为相似。已有研究发现，多糖能够通过刺激巨噬细胞、T淋巴细胞等免疫细胞，阻止病毒在机体内复制而起到抗病毒的目的[10]。

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Anti-IHNV Mechanism of Lentinan Extracts in vitro

REN Guang-ming,XU Li-ming,ZHAO Jing-zhuang,YIN Jia-sheng,LU Tong-yan
（Heilongjiang River Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Harbin 150070,China）

Anti-IHNV（Infectious hematopoietic necrosis virus）activity and antiviral mechanism of Lentinan extracts in vitro were investigated,cytotoxicity as an indicator,based on the cytopathic effect and MTT assay using rainbow trout gonad cell（RTG）lines to evaluate the role of Lentinan extracts in direct inactivation,prevention and the biosynthesis inhibition of IHNV.The results showed that the Lentinan extracts had little cytotoxicity to RTG cells,with direct inactivation rate of 52.84%,prevention rate of 50.38%and IHNV inhibition of 84.41%at mushroom extract concentration of 100 μg/mL.It is inferred that Lentinan extracts has the prominent anti-IHNV activity,and its antiviral mechanism might be primarily involved in the inhibition of intracellular IHNV biosynthesis.

Lentinan extracts;anti-IHNV;antiviral mechanism

S943

A

1005-3832（2017）05-0013-05

2017-04-18

中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目（HSY201514，2016HY-ZD0504）.

任广明（1984-），女，博士研究生，从事水产养殖方向研究.E-mail:gmr25@126.com

卢彤岩，研究员，从事水产病害研究.E-mail:lutongyan@hotmail.com