徐宝欣，杨明宇，李明臣，高 婧，李艳荣，潘海峰△

（1.承德医学院中药研究所/河北省中药研究与开发重点实验室，河北承德 067000；2.河北省滦平县中医院）

中国南北方山楂叶UPLC指纹图谱比较分析*

徐宝欣1，杨明宇1，李明臣2，高 婧1，李艳荣1，潘海峰1△

（1.承德医学院中药研究所/河北省中药研究与开发重点实验室，河北承德 067000；2.河北省滦平县中医院）

目的:通过建立基于主成分分析（PCA）的山楂叶超高效液相色谱（UPLC）指纹图谱对我国南北方山楂叶进行比较分析。方法：采用UPLC法对我国北方（10批）、南方（6批）共16批山楂叶进行分析，建立基于PCA的山楂叶UPLC指纹图谱。结果：通过主成分分析筛选出9批样品、6批样品，分别建立北方和南方山楂叶UPLC指纹图谱。北方山楂叶指纹图谱得到16个共有峰，相似度为0.808-0.972；南方山楂叶指纹图谱得到23个共有峰，相似度为0.923-0.979。结论：本研究构建的基于PCA的山楂叶UPLC指纹图谱能客观评价我国南北方山楂叶药材的差异，可为山楂叶的临床应用提供参考。

山楂叶；主成分分析；指纹图谱

山楂叶是蔷薇科植物山里红Crataegus pinnatifida Bge.Var.Major N.E.Br.或山楂Crataegus pinnatifida Bge.的干燥叶，具有抗血栓、抗心肌缺血、降压、降脂等药理作用[1-3]，其制剂在临床上具有疗效显著、不良反应少的优势[4]。目前，山楂叶及其制剂已得到广泛应用[5-6]。但我国所用山楂叶药材来源有所不同，北方部分省份习用药典收录的山楂叶，南方部分省份习用广山楂叶the Leaves of Malus doumeri(Bois)Chev[7-8]。随着我国对药材质量和来源问题的逐渐重视，有必要对南北不同产地山楂叶进行比较分析，以保证临床疗效。本研究采用超高效液相色谱（UPLC）法，对山楂叶黄酮类活性成分进行指纹图谱研究，并采用主成分分析结合相似度评价，对南北不同产地山楂叶进行比较，以期为山楂叶的临床应用提供理论依据。

1 仪器与试药

Waters AcquityTM超高效液相色谱仪，KQ-700型超声波清洗器，AG-245型十万分之一电子分析天平，HC-2062高速离心机。

牡荆素（111687-200602）、金丝桃苷（111521-200303），中国药品生物制品检定所；绿原酸（120416）、牡荆素葡萄糖苷（151103）、牡荆素鼠李糖苷（151024），上海融禾医药科技有限公司。甲醇、乙腈，色谱纯；娃哈哈纯净水，其它试剂均为分析纯。

16批山楂叶由承德民族师范学院董建新教授鉴定：S1-S10，蔷薇科植物山里红或山楂的干燥叶；S11-S16，蔷薇科苹果属植物台湾林檎Malus doumeri(Bois)Chev.或光萼林檎Malus leiocalyca S.Z.Huang.的干燥叶。药材来源：北方：河北S1-S8，山东S9-S10；南方：广东S11、S15，广西S12-S13、S14、S16。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Waters CORTECS UPLC C18（3.0mm×100mm，1.6μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%乙酸水（B）；进样量：3μl；流速：0.2ml/min；梯度洗脱：T：0min-3min-6min-13min-16min-24min-28min-30min，A：13%-13%-17%-17%-25%-40%-80%-80%；柱温：30℃；检测波长：320nm。

2.2 混合对照品溶液的制备 分别精密称取牡荆素、牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、绿原酸、金丝桃苷对照品适量，甲醇溶解，配制成每1ml含牡荆素0.020mg、牡荆素葡萄糖苷0.097mg、牡荆素鼠李糖苷0.196mg、绿原酸0.033mg、金丝桃苷0.038mg的混合溶液。

2.3 供试品溶液的制备 精密称取山楂叶药材粉末（过60目筛）0.5g，置具塞锥形瓶中，加60%甲醇溶液25ml，称重，超声（700W，40kHz）提取30min；取出置室温，60%甲醇补足失重，摇匀，12000r/min离心10min；0.20μm微孔滤膜过滤，取续滤液，备用。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验：取同一批药材（S7）供试品溶液，按2.1 的色谱条件连续进样5次。结果显示各共有峰相对峰面积RSD＜2.5%，表明仪器的精密度良好。

2.4.2 稳定性试验：取同一药材（S7）供试品溶液，分别于0h、2h、4h、8h、12h、24h，按2.1的色谱条件测定。结果显示各共有峰相对峰面积RSD＜2.5%，说明供试品在24h内稳定。

2.4.3 重复性试验：取同一药材（S7），平行制备供试品溶液6份，分别按2.1的色谱条件测定。结果显示各共有峰相对峰面积RSD＜3%，表明实验方法具有良好的重复性。

2.5 样品筛选

2.5.1 样品测定：制备16批山楂叶供试品溶液，按2.1的色谱条件进样分析。根据《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》进行评价，共标定8个共有峰，相似度（0.366-0.953）差异较大，需采用主成分分析（PCA）进一步分析。2.5.2 主成分分析：以8个共有峰峰面积为变量，运用SPSS 19.0统计软件，计算16批山楂叶成分特征值、贡献率、累计贡献率，结果显示有3个成分的特征值＞1，认定为主成分。计算16批山楂叶主成分得分，绘制样品主成分特征平面图和三维图（图1），筛选出作为建立南北不同产地山楂叶UPLC指纹图谱的样品，北方9批（除S6）、南方6批（S11-S16）。

图1 主成分特征图

2.6 南北不同产地山楂叶指纹图谱共有模式的建立 将2.5.2中筛选出的样品导入国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》，分别建立南北不同产地山楂叶指纹图谱共有模式（叠加图见图2-3）。北方山楂叶指纹图谱共标定16个共有峰，相似度为0.808-0.972；南方山楂叶指纹图谱共标定23个共有峰，相似度为0.923-0.979。因此，基于主成分分析构建的UPLC指纹图谱科学合理，可为南北不同产地山楂叶的指纹图谱研究提供依据。

图2 北方山楂叶药材UPLC指纹图谱叠加图

图3 南方山楂叶药材UPLC指纹图谱叠加图

3 讨论

本研究基于主成分分析，分别对南北不同产地共16批山楂叶样品UPLC指纹图谱进行了比较分析，发现北方山楂叶有16个共有峰，而南方山楂叶有23个。另外，在同一色谱条件下，出峰时间13.05min之前，南北方山楂叶指纹图谱差异不明显；17.39min以后，南方山楂叶出峰较多，可能所含成分种类上存在差异。因此，建议进行山楂叶的相关研究时应注意南北方山楂叶成分种类的差异，仔细甄别筛选，以保证临床疗效。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2015.32.

[2]杨华，张知贵，李小慧.山楂叶总黄酮对高脂血症大鼠血脂和血液流变性的影响[J].中国实验方剂学杂志，2012，18(12)：257-259.

[3]Ku SK, Kwak S, Kwon OJ, et al. Hyperoside inhibits high-glucose-induced vascular inflammation in vitro and in vivo[J].In fl ammation, 2014, 37(5): 1389-1400.

[4]宋玉超，连超杰，李强，等.山楂叶及其制剂对心血管作用的研究进展[J].现代药物与临床，2011，26(1)：25-28.

[5]俞洁琼，张锴，留萍，等.山楂叶总黄酮缓释胶囊的研制及释药机制考察[J].中国新药杂志，2016，25(15)：1758-1764.

[6]杨桦，杨丽美，俞维，等.山楂叶益心酮穴位注射对肥胖大鼠的减肥作用[J].宁夏医科大学学报，2010，32(2)：305-307.

[7]黄燮才.中药山楂原植物的研究[J].广西植物，1989，9(4)：303-310.

[8]李小燕，邓光辉，罗伟强，等.微波萃取广山楂叶中黄酮类化合物的工艺研究[J].生物质化学工程，2007，41(4)：39-42.

COMPARATIVE ANALYSIS OF UPLC FINGERPRINTS OF HAWTHORN LEAVES IN SOUTH AND NORTH CHINA

XU Bao-xin, YANG Ming-yu, LI Ming-chen, et al
(Institute of Chinese Materia Medica/Hebei Key Laboratory of Research and Exploitation of Traditional Chinese Medicine,Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective:To comparatively analyze thehawthorn leavesin south and north China by establishing HPLC fingerprints based on principal component analysis (PCA).Methods:HPLC was used to analyze 16 batches ofhawthorn leavesfrom south (6 batches) and north (10 batches) China, and established HPLC fingerprints based on PCA.Results:9 batches from north China and 6 batches from south China were selected to establish the UPLC fingerprints ofhawthorn leavesbased on PCA.The HPLC fingerprints ofhawthorn leavesfrom north China had 16 common peaks, and the similarity was 0.808-0.972; the HPLC fingerprints ofhawthorn leavesfrom south China had 23 common peaks, and the similarity was 0.923-0.979.Conclusions:The HPLC fingerprints ofhawthorn leavesbased on PCA in this study can objectively evaluate the differences ofhawthorn leavesin south and north China, so it can provide references for clinical application ofhawthorn leaves.

Hawthorn leaves; Principal component analysis; Fingerprint

R284.1

A

1004-6879（2017）06-0456-03

* 河北省高等学校科学技术研究重点项目（ZD2015097），承德市科学技术研究与发展计划项目（201601A043），河北省高校重点学科建设项目资助

△ 通讯作者

2017-02-16）