范妙璇+董娇娇+王京辉+郭洪祝+陈有根+傅欣彤

[摘要] 该文建立了一种同时检测白茅根中16种真菌毒素的QuEChERS（Quick， Easy， Cheap， Effective， Rugged， Safe）超高效液相色谱串联质谱定量分析方法。白茅根以1%乙酸-乙腈超声提取，QuEChERS方法净化，用甲醇和含0.01%甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，超高效液相色谱仪应用Agilent Eclipse Plus C18色谱柱，优化选择在电喷雾离子源正离子模式下以多反应监测方式检测。结果表明，16种真菌毒素在各自线性范围内线性关系良好，相关系数r在0.996 2～1.000，定量限为0.03～186.68 μg·kg-1，回收率为 60.28%～129.2%，RSD为 0.29%～11%。该方法净化效果好、灵敏度高、重复性好，适用于基质成分复杂的白茅根中多种真菌毒素的定量检测。

[关键词] 真菌毒素； QuEChERS法； 超高效液相-三重四级杆联用质谱； 白茅根

[Abstract] A method for the simultaneous determination of sixteen mycotoxins in cogon rootstalk was developed using ultra-performance liquid chromatography coupled with triple quadropole mass spectrometry（UPLC-QqQ-MS/MS）. The samples were extracted with acetonitrile contained 1% acetic acid and purified by QuEChERS method. The separation was performed on an Agilent Eclipse Plus C18 column by gradient elution using methanol and 0.01% aqueous formic acid as mobile phase. The targeted compounds were detected in MRM mode by mass spectrometry with electrospray ionization（ESI）source operated in positive ionization mode. The linear relationships of the sixteen mycotoxins were good in their respective linear ranges. The correlation coefficients（r）ranged among 0.996 2-1.000. The LOQs of the sixteen mycotoxins were between 0.03 and 186.68 μg·kg-1. The average recoveries ranged from 60.28% to 129.2% with relative standard deviations（RSDs）within 0.29%-11%. The results demonstrated that the proposed method was sensitive and accurate， and suitable for the mycotoxins quantification in cogon rootstalk.

[Key words] mycotoxin； QuEChERS； UPLC-QqQ-MS/MS； cogon rootstalk

白茅根為禾本科植物白茅Imperata cylindrical Beauv. var. major（Mees）C. E. Hubb.的新鲜或干燥根茎，具有凉血止血，清热利尿的功效 [1]。在食品、保健食品和中药中有广泛的应用。真菌毒素是真菌产生的次级代谢产物，产毒菌种主要分为曲霉菌毒素（如黄曲霉毒素、赭曲霉毒素等）和镰刀菌毒素（如T-2 毒素、HT-2 毒素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮等）等^[2]。动物试验和流行病学的调查结果表明，许多真菌毒素可在体内积累后产生致癌、致畸、致突变、类激素中毒，白细胞缺乏症等，对机体造成永久性损害^[3]。随着对真菌毒素危害的深入研究，公众逐渐认识到其对社会经济和人类健康造成的严重威胁，各国政府对药品、食品中真菌毒素的分布及检测也都予以了极大的关注，欧美等国家对此设定了严格的限量规定^[4]。真菌毒素检测方法的研究与开发一直是热点和难点，实现快速、准确地同时测定多种毒素是一个长期的技术挑战。QuEChERS（Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged，Safe）法是利用吸附剂填料与基质中的杂质相互作用，吸附杂质从而达到除杂净化的目的。QuEChERS方法回收率较高，精确度和准确度高^[5]，可分析的真菌范围广，分析速度快，溶剂使用量少^[6]，污染小，价格低廉且不使用含氯化物溶剂，操作简便且装置简单^[7]。本文采用QuEChERS-超高相色谱-串联三重四极杆质谱同时测定白茅根中黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2，M1，M2（AFB1，AFB2，AFG1，AFG2，AFM1，AFM2），伏马毒素B1，B2（FB1，FB2），赭曲霉毒素A（OTA），T-2毒素，HT-2毒素，ST毒素，脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON），玉米赤霉烯酮（ZEN），3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇（3-ACE），15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇（15-ACE）等16种真菌毒素，该方法快速、准确，适用于真菌毒素多成分含量测定。

1 材料

1.1 仪器

超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱仪（UHPLC-TSQ QUANTUM，美国Thermo-Fisher公司），配有二极管阵列检测器（PDA）、电喷雾离子源（ESI）、Xcalibur工作站等。1/10万分析天平（赛多利斯CP225D）高速离心机（TGL-16），涡旋仪（IKA-MS3），超声波清洗器（KQ-250DB）。

1.2 试剂

甲醇和乙腈（Fisher公司，HPLC级），实验用水为高纯水，乙酸（色谱纯）；无水硫酸镁、氯化钠、柠檬酸三钠均为分析纯；柠檬酸二钠为分析纯。

1.3 对照品

黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2，M1，M2（AFB1，AFB2，AFG1，AFG2，AFM1，AFM2），伏马毒素B1，B2（FB1，FB2），赭曲霉毒素A（OTA），T-2毒素，HT-2毒素，ST毒素，脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON），玉米赤霉烯酮（ZEN），3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇（3-ACE），15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇（15-ACE），以上对照品均购自美国SUPELCO公司。

1.4 样品信息

56份样品采集自全国，其中海南省3份、安徽省9份、河南省10份、湖南省12份、山西省12份、四川省5份和云南省5份。经中国中医科学院中药资源中心金艳博士鉴定为白茅根。

2 方法

2.1 混合对照品溶液的制备

各精密称取各对照品适量，加甲醇制成含DON，3ACE，15ACE，HT-2，各1万 μg·L-1；ST，T-2，ZEN，各10 μg·L-1；AFB1，AFB2，AFG1，AFG2，各30 μg·L-1；OTA为1 μg·L-1；AFM2为10.6 μg·L-1；AFM1为1 000 μg·L-1；FB1为515 μg·L-1；FB2为442.60 μg·L-1的16种真菌毒素混合对照品溶液。

2.2 样品预处理方法

供试品溶液的制备取白茅根粉末（过40目筛）2.0 g，精密称定，置50 mL离心管中，精密加入8 mL纯净水，涡旋30 s再精密加入1%的乙酸-乙腈溶液20 mL，密闭，超声（500 W，40 kHz）提取30 min，期间振荡2次，取出，再分别精密加入4.0 g无水硫酸镁，1.0 g氯化钠，1.0 g柠檬酸三钠，0.5 g柠檬酸二钠，涡旋振荡2 min，以4 500 r·min-1离心10 min，精密取上清液5 mL，于60 ℃水浴锅挥至近干，用2 mL流动相（起始比例）复溶，涡旋混匀后过0.22 μm微孔滤膜，即得。

2.3 色谱及质谱条件

2.3.1 色谱条件 Agilent Eclipse Plus C18色谱柱（4.6 mm×100 mm，1.8 μm）；流动相为甲醇（A）-含0.01%甲酸水溶液（B），梯度洗脫为0～2 min，50% A；2～5 min，50%～60% A；5～10 min，60%～70% A；10～10.5 min，70%～85%A；10.5～15 min，85%～90% A；15～16.5 min，90%～100%，柱温30 ℃，进样量5 μL。

2.3.2 质谱条件 离子源：电喷雾离子源；检测方式：选择反应离子监测（SRM）；毛细管电压：4.0 kV；雾化气流速：10.0 L·min-1；脱溶剂气流速：30.0 L·min-1；脱溶剂管温度：325 ℃；加热模块温度：325 ℃；采集模式为正离子模式，监测离子对（m/z）和其他参数见表1。

3 结果

3.1 方法专属性

在上述色谱质谱条件下，16种真菌毒素SRM定量离子图见图1。从图可知，16种真菌毒素分离良好，而空白基质加标样品的分析表明基质成分不干扰被测真菌毒素的检测。

3.2 线性关系及定量限

选取不含真菌毒素的白茅根作为空白样品，按样品预处理方法制备空白基质溶液，添加1.3中16种真菌毒素混合对照品溶液分别稀释5，10，50，100，250，500倍，制作基质标准曲线，以待测化合物色谱峰峰面积（Y）为纵坐标，进样浓度（X，ng·kg-1）进行线性回归。线性范围、回归方程及相关系数，见表2。以线性方程中最低添加浓度点的数据，根据3倍信噪比计算16种毒素的检测限，10倍信噪比计算16种毒素的定量限，见表2。

3.3 方法回收率及精密度

取白茅根空白样品2.0 g，共9份，按低、中、高3水平分别添加对照品储备液 50，100，200 μL，每个加标水平平行3份，按上述方法制备供试品溶液并测定，计算各真菌毒素的回收率和相对标准偏差，见表2。结果表明，回收率为60.28%～129.2%，RSD为0.29%～11%。

3.4 样品的检测

取白茅根样品56份，按上述方法测定，结果见表3。

4 讨论

在液质联用分析中，流动相选择需要同时兼顾目标成分分离度和离子化效率。本研究比较了甲醇和乙腈作为流动相A，纯水、1 mmol·L-1乙酸铵、0.01%乙酸和1 mmol·L-1乙酸铵混合溶液、0.01%乙酸及0.01%甲酸为流动相B，同时启用正负离子快速切换模式，开展选择反应监测16种真菌毒素条件优化试验。实验结果表明，甲醇作为流动相A时，其灵敏度明显高于乙腈，因此选择甲醇作为流动相A。

ZEN，OTA，FB1，FB2等化合物在负离子模式下响应值不高，且正负离子同时扫描会降低方法的灵敏度，故选择正离子模式。实验发现，纯水作为流动相B时，多种真菌毒素的离子化效率不高。当流动相中存在乙酸铵时，虽然大部分对照品离子响应加强，但FB1和FB2无响应。通过优化实验发现，乙酸和甲酸均能使待测的16种真菌毒素在正离子模式下有较好的离子响应，但相较而言甲酸离子化效率更好，故选择0.01%甲酸作为流动相B。

白茅根中糖和淀粉含量高，其中糖类含量达总提取物的80%以上^[8]，大量的糖和淀粉类物质导致提取液质地黏稠，且对于所检测的真菌毒素有明显的基质减弱效应。因此，在条件优化时，需要兼顾真菌毒素提取效率及杂质溶解。本文考察了1%乙酸-乙腈溶液、100%乙腈、75%乙腈和50%乙腈的提取效率，结果表明，使用1%乙酸-乙腈溶液提取在满足回收率要求的同时有着更高的检测靈敏度。

在前处理方法上，考察了QuEChERS法和免疫亲和柱法。相对免疫亲和柱的特异选择性强和造价高等特点，QuEChERS法具有更广谱便捷且廉价等诸多优势。相比较QuEChERS法性价比更高，更适合于大批次量样品的检测和快速筛查。另外，本研究还对QuEChERS法开展了进一步优化，提高其回收率的方法考察正在研究进行中。

由于白茅根样本均为野外采集，未采取严格地防霉控制，除植物本身原因外，在采集、干燥、储藏、运输等各个环节都可能会存在污染霉菌，这可能是样品中检出真菌毒素的直接原因。实验结果反映出白茅根容易受到真菌毒素的污染，尤其是黄曲霉毒素类。因此，提示白茅根作为食品或药材时，应特别注意从采集加工到储藏运输等各个环节，严格控制。

[参考文献]

[1] 国家中医药管理局. 中华本草 [M]. 上海： 上海科学技术出版社，1999.

[2] 张鑫， 王福， 陈鸿平， 等. 中药中真菌及真菌毒素污染研究现状[J]， 世界科学技术——中医药现代化， 2015（11）：31.

[3] 韩铮.中药中常见真菌毒素分析方法学及代谢动力学研究[D]. 杭州： 浙江大学， 2011.

[4] 刘满满，康澍，姚成. QuEChERS方法在农药多残留检测中的应用研究进展[J]. 农药学学报， 2013（1）： 8.

[5] 陈建彪， 董丽娜， 刘娇，等. QuEChERS在食品中真菌毒素检测的研究进展[J]. 食品科学， 2014（11）：286.

[6] Arroyo-Manzanares N， García-Campaa A M， Gámiz-Gracia L. Multiclass mycotoxin analysis in silybummarianum by ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry using a procedure based on quechers and dispersive liquid-liquid microextraction[J]. J Chromatogr A， 2013， 1282（5）：11.

[7] Commission Regulation（EU）. No 105/2010： amending regulation（ec）no 1881/2006 settingmaximum levels for certain contaminants in foodstuffs as regards ochratoxin A[S]. 2006.

[8] 刘荣华， 付丽娜， 陈兰英， 等. 白茅根化学成分与药理研究进展[J]. 江西中医学院学报， 2010， 22（4）：80.

[责任编辑 丁广治]