董筱萍 ， 王 瑞 ， 王楠楠 ， 李 石 ， 佟彦林 ， 孙嘉一 ， 周铁忠

(锦州医科大学附属动物医院 ， 辽宁 锦州 121001)

辽宁省猪链球菌病流行特征及其病原类型鉴定

董筱萍 ， 王 瑞 ， 王楠楠 ， 李 石 ， 佟彦林 ， 孙嘉一 ， 周铁忠

(锦州医科大学附属动物医院 ， 辽宁 锦州 121001)

通过从辽宁省的辽东、辽南、辽西、辽北四个区域采集发病猪的淋巴结、脾脏、脑、关节液和脓肿液作为细菌学检测病料，进行猪链球菌病的流行病学调查，以明确辽宁省猪链球菌病发生情况和特点，为进一步建立有效防治技术措施奠定基础。同时对辽宁地区33株致病性猪链球菌，用分子生物学鉴定方法对特异性基因进行血清型鉴定,结果表明，辽宁省地区致病性猪链球菌主要以1、2、7型为主。

辽宁 ； 猪链球菌病 ； 流行特征 ； 病原类型

猪链球菌病是由多种致病性链球菌引起猪多种病理类型的传染病。包括急性败血型、化脓性淋巴炎型、脑膜炎型和关节炎型、心内膜炎等。猪链球菌根据菌体荚膜抗原性不同，分为35个荚膜血清型，其中猪链球菌1/2、1、2、7、9型具有致病性，致病性最强的是猪链球菌2型[1]。我国猪链球菌病发病持续上升，对我国养猪行业及相关从业人员造成了很大的伤害。2015年3月至2016年10月期间，从辽宁省的辽东、辽南、辽西、辽北4个区域采集发病猪的淋巴结、脾脏、脑、关节液和脓肿液作为细菌学检测病料，进行了猪链球菌病的流行病学调查，以明确辽宁省猪链球菌病发生情况和特点，为进一步建立有效防治技术措施奠定基础。同时辽宁省各地区该病发生普遍、病理类型复杂、防治效果不显著，给当地养猪业带来困扰，主要原因是对各地区猪链球菌的血清型、耐药性等还缺乏系统研究[2]，没有制定针对某一地区的防治方案。所以分区分时段采集样品进行细菌的鉴定，以准确查明本地菌株的类型刻不容缓。因此，本试验针对辽宁地区33株致病性猪链球菌，应用基于特异性基因检测比对的分子生物学鉴定方法进行血清型鉴定。研究结果表明，辽宁省地区致病性猪链球菌主要以1、2、7型为主。

1 材料

2015年3月至2016年10期间，对辽宁省4个区域，每个区域选择8～10个规模猪场进行调查，统计不同地区、不同生长阶段、不同季节等的发病率、死亡率、发病类型。采集样本共296份。健康SPFBALB/c小鼠，合格证号：SCXK(吉2003～0002) (锦州医科大学实验动物中心提供)。

2 方法

2.1 流行特征调查 从猪链球菌病发生的病型、变化趋势、不同年龄、不同季节、不同地区混合感染情况进行统计。

2.2 链球菌病的临床诊断方法和标准 参考农业部猪链球菌应急防治技术规范(农医发[2005]20号)，通过临诊发病特点、典型症状和剖检病变特征做出初步诊断[3]。

2.3 致病性试验 小鼠感染试验： 选取3株代表菌株分3组，对照组1组，共4组，每组20只小鼠，小鼠腹腔注射分离菌株BHI液体培养物0.2 mL (2×107CFU/mL) ，对照组腹腔注射相同剂量无菌BHI液体培养物。

动物回归试验： 30日龄断奶健康仔猪8头，分两组，一组腹腔注射2 mL分离菌株(1、2、7、9型)( 2×107CFU/m L)BHI液体培养物。另一组腹腔注射2 mL无菌BHI液体培养物作对照[6]。

2.4 辽宁省猪链球菌的基因型鉴定 提取细菌DNA基因组，用特异性引物验证，进行PCR 扩增，目的片段测序分析。

3 结果与分析

3.1 辽宁省猪链球菌病发生的病型和变化趋势 从病型上来看，辽宁省猪链球菌发病的病理类型多样并复杂化，表现为败血型、脑膜炎型、脓肿型、关节炎型及肺炎混合型，其中，以脑膜炎型、混合型所占比例较高，平均为42.2%、30.65%。从变化趋势看，败血型逐渐减少，脑膜炎型增多，成为主要发病类型，其他类型变化不明显。

3.2 辽宁猪链球菌病不同年龄和季节发病情况统计 从年龄和季节上来看，猪链球菌病在一年四季均有较高的发病率，虽然相同年龄不同季节猪的发病率差异不显著(P>0.05)，但秋季和春季发病率有高于夏季和冬季的趋势，哺乳仔猪冬季发病率最高，可能与温差变化较大有关。分析结果显示，秋季青年猪发病率显著高于成年猪、哺乳仔猪(P<0.05)，春季青年猪发病率显著高于成年猪(P<0.05)，冬季、夏季青年猪发病率与成年猪、哺乳仔猪无显著差异(P>0.05)。

3.3 辽宁不同地区猪链球菌发病和混合感染情况统计 从区域不同的发病和混合感染来看，猪链球菌病在辽宁省各地均有发生，分布广泛，其中营口、鞍山和大连发病率极显著高于其他地区(P<0.01)，可能与上述地区养猪量较大，猪及猪产品运输频繁有关，丹东发病率较低，可能与上述地区养猪量较少，山区多形成天然疫情隔离屏障有关。猪链球菌病70%以上为混合感染，其中多病原混合感染率最高，其次混感较高的病原依次为副猪嗜血杆菌、大肠杆菌、猪繁殖与呼吸综合征病毒。

3.4 辽宁省猪链球菌的分离鉴定结果 经过革兰染色观察到镜下的细菌形态、大小、排列方式非常典型。分离到的链球菌呈链状或双球排列的革兰阳性球菌(见图1)，初步判断为链球菌。生化试验结果均符合其生化特性。动物致病性试验结果：注射小鼠后15 h全部死亡，病变组织染色革兰阳性球菌，对照组未见异常。动物回归试验：试验组动物全部死亡，通过细菌学观察和特异性引物的PCR检测，确定细菌为猪链球菌。

图1 猪链球菌的革兰染色结果

分离菌株经过16S rRNA PCR验证，目的片段约1 450 bp左右，见图2。经对比分离菌株序列的结果与生化鉴定的结果一致。

3.5 辽宁省猪链球菌的基因型鉴定 应用1、2、7、9型特异性基因对辽宁分离的猪链球菌流行菌株进行鉴定见图3，结果表明,检测2015年至2016年来辽宁的疑似猪血液、脑脊液、肝、脾、淋巴结样品33份，检出1型13份，2型14份,7型6份，阳性率分别为39.0%、42.0%和18.0%。主要有1、2、7型。

图2 猪链球菌16S rRNA序列电泳结果

图3 猪链球菌1型、2型、7型电泳结果

4 讨论

结合调查明确了辽宁地区猪链球菌病发病日龄、季节、地区等特征，确证了该地区猪链球菌病的病型和变化趋势，猪链球菌病表现为败血型、脑膜炎型、脓肿型、关节炎型及肺炎混合型，败血型逐渐减少，脑膜炎型和肺炎型增多，成为主要发病类型。该病在一年四季均有较高的发病率，但秋季和冬季发病率显著高于夏季和冬季，保育猪春秋季节发病率较高。

应用细菌形态学、生物化学试验、分子生物学方法，从辽宁地区鉴定了33株猪链球菌，通过动物致病性试验可以100%致死小鼠和本动物仔猪。说明辽宁猪链球菌流行菌株具有很强的致病性。

应用特异性基因检测分析方法确定了辽宁地区流行菌株主要血清型为1型、2型和7型。为辽宁地区建立有针对性的防治技术措施提供了基础依据。

[1] Higgins R,Gottschalk M. Distribution of Streptococcus suis capsular types in 2000[J].2001,42(03):223-224.

[2] 吴德，罗会明,郑慧贞.人-猪链球菌病流行病学研究进展[J].中华流行病学杂志,2007,28(4):402-404．

[3] 闵文龙.猪链球菌病的防治[J].医学动物防制,2007,23(2):154-155.

S855.3

B

0529-6005(2017)08-0081-02

2017-03-29

辽宁省百千万人才工程资助项目(2014921012)；辽宁省农业科技攻关重点项目(2011214001,LYHX2013035)

董筱萍(1984-),女，助教,硕士,从事教学与动物诊疗工作, E-mail:dongxiaoping2032@163.com

周铁忠,E-mail:ztz1818@126.com