宋晶伟 ， 王晨曦 ， 张谞霄 ， 孙洪磊 ， 彭金山 ， 蒲 娟

(1. 中国农业大学动物医学院 ， 北京 海淀 100193 ； 2. 北京市农业局 ， 北京 西城 100029)

北美H3N8亚型犬流感病毒双重RT-PCR检测方法的建立

宋晶伟1， 王晨曦1， 张谞霄1， 孙洪磊1， 彭金山2， 蒲 娟1

(1. 中国农业大学动物医学院 ， 北京 海淀 100193 ； 2. 北京市农业局 ， 北京 西城 100029)

H3N8亚型犬流感病毒在北美地区广泛流行，并引发犬的呼吸道疾病，但目前中国尚未有犬感染H3N8亚型犬流感病毒的报道。随着近几年宠物贸易的繁盛，犬流感流行区域可能逐渐扩大，增加北美H3N8亚型犬流感病毒传入中国的可能。因此，需要建立一种针对北美H3N8亚型犬流感病毒的快速检测方法。本研究中，我们建立了针对北美H3N8亚型犬流感病毒的HA和NA基因片段的双重RT-PCR检测方法。该方法可特异性地检出北美H3N8亚型犬流感病毒HA和NA基因，而未检出H3N2亚型犬流感病毒及其他亚型流感病毒、犬瘟热病毒、传染性肝炎病毒、犬细小病病毒、副流感病毒；检测方法灵敏度可达0.1 pg/μL。利用该方法对临床样本进行了检测，证实该检测方法可靠。该检测方法的建立为监测北美H3N8亚型犬流感病毒提供了良好的技术支撑，可用于外来犬流感病毒的检测。

H3N8 ； 犬流感病毒 ； 双重RT-PCR

流感病毒可以引起家禽和人、马、猪等哺乳动物的急性呼吸道疾病。2004年，美国弗罗里达州的灰猎犬暴发了急性呼吸道疾病，研究人员从死亡病例中分离到H3N8亚型流感病毒[1]。随后在狗舍、宠物医院的其他品种犬中也分离到了H3N8病毒，且与早期在灰猎犬中分离到的病毒同源性接近。多数病犬出现了上呼吸道病毒感染的临床症状，包括咳嗽、流鼻涕、低热。一些死亡病例出现了肺部、胸腔膈膜、胸膜腔广泛性出血，组织病理学检查出现气管炎、支气管炎、细支气管炎及化脓性支气管肺炎，暗示了H3N8亚型流感病毒能够有效地感染犬[2]。2008年，美国有25个州出现了宠物犬感染病例；2009年，美国加利福尼亚州南部的一个狗舍暴发H3N8犬流感疫情，有64只狗出现流感症状；截止2009年5月，有30个州发现犬流感的存在，发病场所多为宠物店和犬场等[3]。

犬作为人类的伴侣，人与犬的亲密接触增加犬作为中间宿主将病毒传播给人类的可能性[4]。因此，犬流感病毒不仅影响犬的健康，也对公共卫生安全构成了严重威胁。H3N8和H3N2是犬流感病毒的主要流行亚型，H3N8犬流感主要流行区域是美国，H3N2犬流感主要在亚洲地区流行。然而，随着宠物市场的繁盛，各亚型犬流感流行区域逐渐扩大。2015年美国暴发亚洲H3N2病毒。Pei Zhou等人对2015年5月至2015年11月份自广州、上海、北京、深圳分离的600份犬血清进行血清学检测发现，5份(0.83%)对H3N8亚型流感病毒(H3N8 马流感病毒或H3N8禽流感病毒)检测为阳性[5]。这强调加强对犬流感病毒检测的必要性，因此建立一种特异性好、灵敏度高、快速的检测方法，对于H3N8亚型犬流感病毒预防和控制十分重要。本研究我们建立了针对北美H3N8亚型犬流感病毒的双重RT-PCR检测方法，并对该方法的特异性和灵敏度进行了优化和评价，该方法的建立对监测北美源H3N8亚型犬流感病毒入境传播具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒 北美H3N8亚型犬流感病毒A/canine/lowa/13628/2005(H3N8) HA、NA基因质粒，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.1.2 病毒 A/canine/Beijing/364/2009(H3N2)、A/chicken/Tangshan/2/2015(H9N2)、A/California/04/2009(H1N1)、犬瘟热病毒、传染性肝炎病毒、犬细小病病毒、副流感病毒由本实验室保存。

1.1.3 试剂 组织/细胞基因组DNA快速提取试剂盒由Aidlab公司生产；Roche(罗氏)病毒RNA提取试剂盒由Roche公司生产；反转录试剂盒由Promega公司生产；反转录流感特异性引物为Uni 12 ：5′-AGCAAAAGCAGG-3′，由北京擎科新业生物技术有限公司合成；2×TaqMix、Trans DNA MarkerⅠ由北京全式金生物技术有限公司生产。

1.1.4 测序引物 A型流感病毒HA和NA基因通用引物[6]，由北京擎科新业生物技术有限公司合成。

1.1.5 临床样品 2015-2016年自中国农业大学动物医院采集52份犬鼻咽拭子临床样品，置于-80 ℃保存。

1.2 引物设计与合成 利用MEGA 6.0对GenBank中H3N8亚型犬流感病毒HA、NA基因序列进行比对，以北美H3N8亚型犬流感病毒A/canine/lowa/13628/2005(H3N8)的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因为参考序列，利用Primer Premier 5.0软件针对H3N8亚型犬流感病毒HA和NA基因保守区分别设计合成特异性引物。引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成。

1.3 总RNA提取及反转录、总DNA提取 按照罗氏病毒RNA提取试剂盒说明书分别提取H3N2亚型犬流感病毒、H9N2亚型禽流感病毒、H1N1亚型禽流感病毒、犬瘟热病毒、副流感病毒总RNA，并用引物Uni 12进行反转录形成cDNA；按照组织/细胞基因组DNA快速提取试剂盒说明书提取传染性肝炎病毒、犬细小病病毒总DNA；产物做PCR扩增。

1.4 反应条件的优化 通过对HA∶NA引物的摩尔比及反应参数(包括退火温度、退火时间、延伸时间、循环次数)进行优化，具体如下：(1)HA∶NA引物摩尔比(2∶1,3∶2,1∶1,2∶3,1∶2)；(2)退火温度(50 ℃,53 ℃,56 ℃,59 ℃,62 ℃)；(3)退火时间(30 s,45 s)；(4)延伸时间(30 s,45 s,60 s,75 s,90 s)；(5)循环次数(27,30,33,36,39个)，筛选出双重RT-PCR最佳反应体系及反应条件。

1.5 特异性试验 用建立的检测方法分别对北美H3N8犬流感HA和NA质粒混合物、H3N2犬流感病毒、H1N1禽流感病毒、H9N2禽流感病毒、犬瘟热病毒、副流感病毒、传染性肝炎病毒、犬细小病病毒进行检测，并设置阴性对照，以评价该方法的特异性。

1.6 敏感性试验 将A/canine/lowa/13628/2005(H3N8) HA、NA质粒分别稀释至初浓度为1ng/μL，再依次进行10倍倍比稀释，作为模板进行 RT-PCR 扩增，评价该方法的敏感性。

1.7 临床样本检测

1.7.1 双重RT-PCR检测方法应用本研究建立的双重RT-PCR检测方法，对2015-2016年采集自中国农业大学动物医院52份犬鼻咽拭子临床样品进行检测，对双重RT-PCR检测为阳性的样品，运用HA、NA基因通用引物进行全长扩增并克隆测序，验证双重RT-PCR所得结果。

1.7.2 传统检测方法将相同的52份临床样品，用PBS处理，4 ℃过夜，用传统鸡胚接种的方法进行病原分离，通过血凝试验鉴定是否分离到流感病毒，收集有血凝性的鸡胚尿囊液，提取RNA，运用HA、NA基因通用引物进行全长扩增并克隆测序，并与双重RT-PCR检测的结果进行比较。

2 结果与分析

2.1 引物设计与筛选 针对H3N8亚型犬流感病毒HA和NA基因保守区域分别设计5对引物。将引物分别组合进行PCR扩增，根据条带特异性和灵敏度，筛选出1组引物。HA引物序列：F:5′-TTAGTTCAGAGCATTTCAATGGGGA-3′；R:5′-TGTTTATCATTAGGATATCTCCAGG-3′；NA引物序列：F:5′-CAGTTGGAGTCACAGGGCCCGACAA-3′；R:5′-GTACATGAGCCTGTGAATTGACTAT-3′，扩增出目的片段大小分别约600 bp、400 bp。

2.2 RT-PCR检测方法的优化 通过对北美H3N8亚型犬流感病毒双重RT-PCR检测方法进行优化，最终确定北美H3N8亚型犬流感病毒HA∶NA引物的最佳摩尔比为2∶1，最佳退火温度、退火时间、延伸时间、循环次数分别为59 ℃、30 s、45 s、30个循环。

2.3 特异性评价 特异性试验结果表明，只有H3N8亚型犬流感病毒HA和NA质粒混合物扩增出2条与试验设计大小相符的条带(600 bp和400 bp)，其他毒株均未见扩增条带(图1)。以上结果与预期结果相一致，说明所建立的双重RT-PCR检测方法具有良好的特异性。

图1 北美H3N8亚型犬流感病毒HA和NA基因双重RT-PCR检测方法的特异性评价

2.4 敏感性评价 将北美H3N8亚型犬流感病毒HA和NA质粒分别稀释至初浓度为1ng/μL，再依次进行10倍倍比稀释，作为模板进行RT-PCR扩增，评价该方法的敏感性。如图2所示，HA和NA引物对组合能检测出的最低质粒浓度为0.1 pg/μL。

2.5 临床样本检测结果 用本试验建立的双重RT-PCR检测方法，对52份犬鼻咽拭子临床样品进行检测，均无阳性条带；通过传统鸡胚接种的方法进行病原分离，尿囊液均无血凝性，未分离到流感病毒。

图2 北美H3N8亚型犬流感病毒HA和NA基因双重RT-PCR检测方法的敏感性评价

本试验建立的检测方法对临床样品检测结果与传统检测方法一致，未检测到北美H3N8亚型犬流感病毒。

3 讨论

近年来，甲型流感病毒感染犬的报道不断出现，包括H3N8、H3N2、H5N1、H1N1亚型流感病毒，其中，美国、英国、澳大利亚等国家均有H3N8犬流感疫情的报道[7]，但目前，中国尚未有犬感染H3N8亚型犬流感病毒的报道。随着近几年宠物市场扩展，H3N8亚型犬流感病毒可能不再具有地方流行性，增加北美H3N8亚型犬流感病毒传入中国的可能，因此，需要建立一种针对北美H3N8亚型犬流感病毒的快速检测方法。

在美国首次报道H3N8亚型犬流感病毒时，血凝抑制试验被用来诊断病毒感染[8]，但是血凝抑制试验涉及到病原的分离，操作相对繁琐，且各亚型之间容易相互影响，敏感性较低，耗时耗力。目前，单重RT-PCR和real-time RT-PCR等诊断方法被用来诊断H3N8亚型犬流感病毒感染[9]。本研究所建立的针对北美H3N8亚型犬流感病毒HA和NA基因的双重RT-PCR检测方法，是在普通RT-PCR基础上，在同一PCR反应体系中加入2对引物进行扩增，可同时确定H3和N8亚型，节约了检测试剂，简化了反应程序，具有省时省力的优点，而且降低诊断成本。

本研究针对H3N8亚型犬流感病毒HA、NA基因保守区域分别设计了2对特异性引物，成功建立了H3N8亚型犬流感病毒双重RT-PCR检测方法，并对反应条件进行了优化。该方法能检测出的最低质粒浓度为0.1 pg/μL，具有良好的敏感性，且应用该引物对H3N2亚型犬流感病毒、H1N1禽流感病毒、H9N2禽流感病毒、犬瘟热病毒、传染性肝炎病毒、犬细小病病毒、副流感病毒，在相同的反应条件下未扩增出任何片段，具有较好的特异性。用所建立的检测方法对52份犬鼻咽拭子临床样品进行检测，并与病毒分离、血清学试验检测结果比较，证实该方法可靠。

本文所建立的针对北美H3N8亚型犬流感病毒的双重RT-PCR检测方法特异性强、敏感性高，为该病的流行病学调查与诊断提供一种方法。

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DuplexRT-PCRassayfordetectionofNorthAmericanH3N8subtypecanineinfluenzavirus

SONG Jing-wei1, WANG Chen-xi1, ZHANG Xu-xiao1, SUN Hong-lei1, PENG Jin-shan2, PU Juan1

(1.College of Veterinary Medicine, China Agricultural University, Beijing 100193，China;2. BeijingBureau of Agriculture, Beijing 100029,China)

H3N8 subtype canine influenza virus has spread through North America and resulted in respiratory diseases. However , at present the case of dogs infected with the virus has not been reported in China. As the pet trade has flourished in recent years, it also increases the possibility of transmitting the virus into our country. Therefore, it is necessary to establish a specific and sensitive method for the detection of the H3N8 subtype canine influenza virus. In this study, a duplex RT-PCR (dRT-PCR) was established. Two primer sets targeting the hemagglutinin (HA) gene and the neuraminidase (NA) gene of North American H3N8 subtype canine influenza virus were designed , respectively were designed. The amplification by the duplex RT-PCR assay was positive for North American H3N8 subtype canine influenza virus but negative for H3N2 subtype canine influenza virus, other subtypes (H1N1 and H9N2) of influenza viruses, canine distemper virus, infectious canine hepatitis virus, canine parvovirus and parainfluenza virus. The sensitivity was 0.1 pg/μL. The detection of clinical samples was carried out, and proved that this method was feasible. This detection method will provide effective technical support for monitoring the North American H3N8 subtype canine influenza virus and can be used in the surveillance of exotic diseases.

H3N8 ; canine influenza virus ; duplex RT-PCR

PU Juan

S852.65+5

A

0529-6005(2017)08-0026-03

2016-11-02

“十二五”国家科技支撑项目(2013BAD12B01)

宋晶伟(1992-)，女，硕士生，从事流感病毒研究工作，E-mail：15600912168@163.com

蒲娟，E-mail：pujuan@cau.edu.cn