韩 冉，李 卿，王汝华，孔 宇，梁增澜，张 金，赵慧慧

铁皮石斛多糖提取工艺优化及分子量分析

韩 冉，李 卿，王汝华，孔 宇，梁增澜，张 金，赵慧慧

（天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457）

铁皮石斛中含有较高的石斛多糖，以新鲜铁皮石斛为原料，采用酶解法和超声法提取，通过单因素试验和正交试验优化2种提取方式的工艺条件，比较其多糖得率，并对提取得到的多糖分子量进行了初步分析。结果表明，酶解提取法的最优工艺参数为提取液pH值6.0，果胶酶浓度1 500 U/L，提取温度60℃；超声辅助提取法的最优工艺参数为超声频率24 kHz，超声时间20 min，超声温度25℃。高效液相色谱分析的结果显示，超声法提取后的铁皮石斛多糖分子量高于酶解法。

铁皮石斛；多糖；酶解；超声；分子量

0 引言

铁皮石斛（Dendrobium candidum Wall.ex Lindl）位列“中华九大仙草”之首[1]，享有“药中黄金”的佳誉。其药用部分为新鲜或干燥茎，有益胃生津、滋阴清热、免疫调节、延缓衰老等功效。但石斛属植物生长缓慢，对生长环境要求严格[2]，严重的供求失衡最终导致石斛资源短缺，价格昂贵。近年来，为了缓解石斛属植物的严峻现状，开始研究人工栽培技术，但人工栽培石斛的化学成分与野生石斛存在较大差异。因此，如何最大限度提取石斛中的有效化学成分是研究者亟待解决的问题。

铁皮石斛化学组分主要包括石斛多糖、生物碱、游离氨基酸、矿物质元素等[3]，其中石斛多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、抗疲劳、降血糖[4-8]等作用。水提醇沉法是提取多糖最常用的方法，也是较为传统的一种方法，但其试剂使用量大、提取多糖得率较低。采用酶解提取法和超声辅助提取法，通过单因素试验和正交试验优化2种提取方式的工艺参数，最大限度地提取石斛多糖。同时，通过高效液相色谱分析2种提取方式下石斛多糖的结构，为进一步探究其结构及生物学活性奠定一定理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料和设备

3年生仿野生铁皮石斛鲜条（含水量约75%），产自浙江乐清雁荡山；果胶酶（30 000 U/mL），Solarbio公司提供；HK-08型摇摆式粉碎机，广州市旭朗机械设备有限公司产品；722型可见分光光度计，上海舜宇恒平科学仪器有限公司产品；FD-10型冷冻干燥机，北京德天佑科技发展有限公司产品；LC Solution 1.26 SP1型高效液相色谱系统，日本岛津公司产品。

1.2 铁皮石斛的干品制备

将新鲜铁皮石斛的茎部截成长1～2 cm的小段，置于鼓风干燥箱内于50℃条件下烘干3～4 h，再经摇摆式粉碎机进行粉碎，过80目筛后备用。

1.3 石斛多糖的提取工艺流程

（1） 酶解提取法。80目石斛粉→加热浸提→果胶酶水解→灭酶处理→抽滤去除不溶杂质→真空浓缩→醇沉多糖→离心→沉淀复溶→真空浓缩→冷冻干燥→石斛多糖。

（2） 超声辅助提取法。80目石斛粉→加水溶解→超声提取→抽滤去除不溶杂质→真空浓缩→醇沉多糖→离心→沉淀复溶→真空浓缩→冷冻干燥→石斛多糖。

1.4 石斛多糖提取工艺优化

（1） 酶解提取法单因素试验与正交试验设计。在提取液pH值6.0，提取温度60℃的条件下，依次添加果胶酶至终浓度0，300，900，1 500，2 100，2 700 U/L，分析果胶酶浓度对石斛多糖得率的影响。果胶酶终浓度1 500 U/L，提取温度60℃的条件下，依次改变提取液pH值5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，分析提取液pH值对石斛多糖得率的影响。在果胶酶终浓度1 500 U/L，提取液pH值6.0的条件下，依次改变提取温度40，50，60，70，80℃，分析提取温度对石斛多糖得率的影响。依照试验结果，利用L9（34）正交试验方案，进一步研究果胶酶浓度、提取液pH值、提取温度对石斛多糖得率的影响。

酶解提取法正交试验因素与水平设计见表1。

表1 酶解提取法正交试验因素与水平设计

（2）超声辅助提取法单因素试验与正交试验设计。在超声频率24 kHz，超声温度25℃的条件下，依次改变超声时间0，5，10，15，20，25 min，分析超声时间对石斛多糖得率的影响。在超声频率24 kHz，超声时间20 min的条件下，依次改变超声温度20，25，30，35，40℃，分析超声温度对石斛多糖得率的影响。在超声时间20 min，超声温度25℃的条件下，依次改变超声频率16，20，24，28，30 kHz，分析超声频率对石斛多糖得率的影响。依照试验结果，利用L9（34）正交试验方案，进一步研究超声时间、超声温度、超声频率对石斛多糖得率的影响。

超声辅助提取法正交试验因素与水平设计见表2。

1.5 石斛多糖得率的测定

采用苯酚-硫酸法测定石斛多糖的浓度。

1.5.1 标准曲线的绘制

表2 超声辅助提取法正交试验因素与水平设计

式中：c——查标准曲线所得葡萄糖质量浓度，g/L；

v——溶剂体积，L；

N——稀释倍数；

m——石斛质量，g。

1.6 石斛多糖相对分子质量的测定

采用高效液相色谱法（HPLC） 测定石斛多糖分子质量。色谱条件：GPC色谱柱为OHpak SB-802.5 HQ型；流动相为三蒸水；流速为0.8 mL/min；柱温为30℃；柱压为3.0 MPa；采用示差折光检测器检测。样品质量浓度10 mg/mL，进样量20 L，0.45 m滤膜过滤后进样。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 酶解提取法单因素试验

（1）果胶酶浓度对石斛多糖得率的影响。果胶酶浓度对石斛多糖得率的影响见图1。

精密称取干燥（60℃）恒质量的葡萄糖20 mg，用蒸馏水溶解并稀释至500 mL，得葡萄糖标准液。精密吸取标准液 0，400，600，800，1 000，1 200 μL，分别置于试管内，加蒸馏水至2.0 mL，再各加6%苯酚试剂1.0 mL，各管迅速滴加浓硫酸5.0 mL，静置10 min，立刻摇匀，用可见分光光度计于波长490 nm处测定吸光度[9]。以吸光度为纵坐标、葡萄糖质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到回归方程Y=0.045X+0.000 3。

1.5.2 石斛多糖得率的计算公式

图1 果胶酶浓度对石斛多糖得率的影响

由图1可知，果胶酶浓度对石斛多糖得率有较大的影响，当果胶酶浓度为1 500 U/L时，石斛多糖得率最高为13.94%。这可能是由于石斛植物细胞壁富含果胶，通过果胶酶将细胞壁上的果胶水解，使溶剂进入细胞内，加速石斛多糖的溶出[10]。当果胶酶浓度增加到一定值时，果胶酶除完成对细胞壁的分解作用外，对石斛多糖的分解作用也加剧，石斛多糖得率反而下降[11]。

（2）提取液pH值对石斛多糖得率的影响。

提取液pH值对石斛多糖得率的影响见图2。

图2 提取液pH值对石斛多糖得率的影响

由图2可知，当提取液pH值为6.0时，石斛多糖得率达到最高为14.21%；然后随着提取液pH值的增大，石斛多糖得率有所下降。可见石斛多糖较宜在微酸的环境下提取，也可能是果胶酶在酸性条件下酶活力较高[12]的原因。

（3）提取温度对石斛多糖得率的影响。

提取温度对石斛多糖得率的影响见图3。

图3 提取温度对石斛多糖得率的影响

由图3可知，随着提取温度的升高，石斛多糖得率先升高再降低。这是由于提取温度的升高使石斛多糖的溶解度增加，加快了传质过程的速度，较高的温度对细胞壁的破坏作用较大，有利于石斛多糖的溶出。当提取温度为60℃时，石斛多糖提取得率达到最大值为14.08%。随着提取温度的继续升高，石斛多糖中存在着的不稳定成分结构发生改变而产生降解。同时，由于非糖物质的溶出，也会造成石斛多糖得率的下降[13]。此外，由于提取温度升高，还可能导致石斛多糖提取液的黏度增大，不容易分离，从而导致石斛多糖得率的下降[14]。

2.1.2 超声辅助提取法单因素试验

（1）超声时间对石斛多糖得率的影响。

超声时间对石斛多糖得率的影响见图4。

由图4可知，随着超声时间的延长，石斛多糖得率明显升高。当超声时间达到20 min时，其得率最大为15.45%，这是由于超声产生的空化效应能加速石斛多糖的溶出；然后随着超声时间的延长，石斛多糖得率趋于平缓并略有下降。可能是由于超声时间延长，超声作用产生的机械剪切力增大，使糖苷键断裂，一定程度上破坏了石斛多糖的结构[15]，导致其得率略有下降。

图4 超声时间对石斛多糖得率的影响

（2）超声温度对石斛多糖得率的影响。

超声温度对石斛多糖得率的影响见图5。

图5 超声温度对石斛多糖得率的影响

由图5可知，超声温度对石斛多糖得率的影响并不显著。超声温度为25℃时，石斛多糖得率最大为15.55%。随着超声温度的继续升高，其得率略有下降。这可能是由于超声能使细胞内产生巨大的能量，细胞内温度高过设定温度，加速了多糖的溶出，温度越高，越多地破坏多糖的结构。

（3）超声频率对石斛多糖得率的影响。

超声频率对石斛多糖得率的影响见图6。

图6 超声频率对石斛多糖得率的影响

由图6可知，随着超声频率的增加，石斛多糖得率先升高后下降。当超声频率达24 kHz时，石斛多糖得率最高为15.68%；当超声频率超过24 kHz时，其石斛多糖得率有所下降。可能是由于超声频率过大使石斛多糖发生降解，还可能是超声频率升高产生气泡导致超声波相互反射，从而减少了能量传递[16]；或者是提取液流动加快，使石斛原料在超声场停留时间缩短，导致破壁作用减弱，从而使石斛多糖得率有所下降[17]。

2.2 正交试验

2.2.1 酶解提取法正交试验结果

酶解提取法试验设计及结果见表3，酶解提取法试验方差分析见表4。

表3 酶解提取法试验设计及结果

表4 酶解提取法试验方差分析

由表3～表4可知，3个因素的作用强弱依次为提取液pH值＞果胶酶浓度＞提取温度。A2B2C2为最佳工艺组合，即提取液pH值为6.0，果胶酶浓度为1 500 U/L，提取温度为60℃。用上述最优工艺条件进行验证试验，得到石斛多糖得率为14.89%±0.053%。

2.2.2 超声辅助提取法正交试验结果

超声辅助提取法试验设计及结果见表5，超声辅助提取法试验方差分析见表6。

由表5～表6可知，3个因素的作用强弱依次为超声频率＞超声时间＞超声温度。因此，正交试验确定的最优参数组合为A'2B'2C'2。根据正交试验结果，在超声频率24 kHz，超声时间20 min，超声温度 25℃的条件下进行验证试验，得到的石斛多糖得率为15.78%±0.072%。

2.3 石斛多糖相对分子质量的测定

通过HPLC检测酶解提取法与超声辅助提取法提取石斛多糖的分子质量分布。

酶解提取法石斛多糖的分子质量分布见图7，超声辅助提取法石斛多糖的分子质量分布见图8。

通过计算，酶解提取法的多糖组分较少，主要由1种组分组成，分子量在1 000～70 kDa；超声辅助提取的多糖组分比较多，分子量分布广泛，为2 000～10 kDa。

表5 超声辅助提取法试验设计及结果

表6 超声辅助提取法试验方差分析

图7 酶解提取法石斛多糖的分子质量分布

图8 超声辅助提取法石斛多糖的分子质量分布

3 结论

以铁皮石斛为原料，探究铁皮石斛提取多糖的研究过程。确定了最优酶解工艺参数为提取液pH值6.0，果胶酶浓度1 500 U/L，提取温度60℃，石斛多糖得率为14.89%±0.053%；超声辅助提取法的最优工艺参数为超声频率24 kHz，超声时间20 min，超声温度25℃，石斛多糖得率为15.78%±0.072%。

酶解法较超声法的优点是提取条件温和、节约能源、操作简单方便，可以省去部分设备，提取出的多糖分子量较小、易于复溶、便于人体吸收。而超声法能最大程度地保持石斛多糖的结构，不引入除原料外的其他物质，节省时间，经济效益较高。这2种方法各有利弊，但都能较大程度地提取铁皮石斛多糖功能性成分，可以针对不同人群，添加到相关产品中，深度挖掘其潜在的利用价值。

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Extraction Technology Optimization and Molecular Weight Analysis of Polysaccharide from Dendrobium candidum

HANRan，LI Qing，WANG Ruhua，KONG Yu，LIANG Zenglan，ZHANG Jin，ZHAOHuihui
（College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science&Technology，Tianjin 300457，China）

Dendrobium candidum contains high Dendrobium polysaccharides.In this study， fresh Dendrobium candidum is used as raw material and extracted by enzymatic hydrolysis and ultrasonic method.The process conditions of two extraction methods are optimized by single factor test and orthogonal test.The molecular weight of polysaccharides is analysis.The results show that the optimum enzymatic extraction conditions are as follows pH 6.0，pectinase concentration 1 500 U/L，extraction temperature 60 ℃.The optimum parameters of ultrasonic assisted extraction are ultrasonic frequency 24 kHz，ultrasonic time 20 min，ultrasonic temperature 25℃.The results of high performance liquid chromatography show that the molecular weight of polysaccharides by ultrasonic assisted extraction is higher than that by enzymatic extraction.

Dendrobium candidum；polysaccharide；enzymatic hydrolysis；ultrasonic；molecular weight

TS210.2

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.09.008

1671-9646（2017） 09a-0028-05

2017-07-11

天津科技大学大学生实验室创新基金（1614A208）。

韩 冉（1989— ），女，硕士，实验师，研究方向为食品分析。