吴 昊，甄天元，陈存坤，王艺颖，罗 丹，张 潇，王成荣



壳聚糖没食子酸衍生物酶法制备及对鲜切苹果的保鲜效果

吴 昊1，甄天元1，陈存坤2，王艺颖1，罗 丹1，张 潇1，王成荣1※

（1. 青岛农业大学食品科学与工程学院，青岛 266109； 2. 国家农产品保鲜工程技术研究中心，天津 300384）

为提高壳聚糖水溶性和保鲜性能，该文以没食子酸为配体，漆酶为催化剂催化壳聚糖与没食子酸发生接枝反应，得到壳聚糖没食子酸衍生物，对其结构进行了初步表征，并初步探讨了其对鲜切苹果的保鲜效果。结果表明，衍生物接枝率为72.80%，溶解度达到92.77%，没食子酸中的羧基与壳聚糖分子的氨基发生了迈克尔加成反应，在壳聚糖的C2位生成了酰胺键。14 ℃下贮藏4 d后，10 mg/mL衍生物处理的苹果硬度损失率仅为10.23%，比空白组、壳聚糖处理组和壳聚糖没食子酸物理复合物处理组分别低20.90% (<0.05)、16.60% (<0.05)和15.60% (<0.05)；可溶性固形物、维生素C、谷胱甘肽和多酚质量分数分别为12.93%， 1.23 mg/(100 g)， 6.26 mg/(100 g)和6.24 mg/(100 g)，分别比空白组高16.47% (<0.05)，48.78% (<0.05)，24.92% (<0.05)和43.75% (<0.05)；多酚氧化酶和过氧化物酶活性分别比空白组低36.73% (<0.05)和76.94% (<0.05)；菌落总数为16.00 ×104CFU/g，显著低于空白组、壳聚糖处理组和壳聚糖没食子酸物理复合物处理组 (<0.05)。结果表明，漆酶可催化壳聚糖与没食子酸发生接枝反应，得到的壳聚糖没食子酸衍生物对鲜切苹果具有较好的保鲜效果。

贮藏；品质控制；水果；壳聚糖；没食子酸；漆酶；保鲜

0 引 言

壳聚糖（chitosan，CTS）是甲壳素（chitin）脱乙酰基后得到的一种无毒的、生物可降解的多糖，具有成膜性和广谱抗菌性，被广泛应用于食品保鲜领域[1]。但是壳聚糖分子间的强氢键作用致使高分子质量的壳聚糖不溶于水，并且壳聚糖的抗氧化能力主要是来源于氨基上N的螯合能力以及氨基和羟基较弱的给电子能力，属于次级型抗氧化剂[2]，在一定程度上限制了它在食品保鲜中的应用。因此，对壳聚糖进行改性，在提高其溶解度的同时并赋予其新的特性，已成为研究开发壳聚糖衍生物的方向之一[3]。

没食子酸（gallic acid，GA）是一种从植物特别是绿茶中提取的天然酚类抗氧化剂，具有较强的清除自由基和抗氧化作用。没食子酸作为初始型抗氧化剂，可以很好地提供氢原子或电子以抑制氧化链的反应[4]，但是没食子酸作为小分子抗氧化剂的稳定性较差，在高温、光照等条件下易分解。已有研究者采用化学方法将其结合到壳聚糖分子上来增强壳聚糖的抗氧化性[4-7]并提高没食子酸的稳定性[5]，本课题组前期也对壳聚糖没食子酸衍生物的化学合成进行了研究，并将其应用于鲜切果蔬的保鲜试验中，取得了理想的结果[6]。但化学方法存在着反应步骤多、专一性差等特点，随着人们环保意识的增强，作为绿色化学研究的一个重要部分，生物催化剂-酶用于高分子的合成及改性正成为一个新的研究热点。酶法制备的壳聚糖没食子酸衍生物无任何化学残留和毒副作用，符合人们对食品保鲜绿色、环保的要求。

漆酶（EC1.10.3.2）是一种含铜的多酚氧化酶，在果汁加工、生物漂白、物质合成和废水处理等方面有广泛应用，它利用铜离子特有的氧化还原能力氧化酚类和芳香类化合物，利用自由基反应机理完成4个电子的转移，同时将分子氧还原成水[8]，酚类化合物是典型的漆酶底物，它们的氧化还原电势较低，可以允许电子传递给CuI，反应过程中，酚被氧化成苯氧自由基，根据反应条件的不同，可以进一步通过自由基耦合反应产生聚合或重排产生苯醌，漆酶可以使酚型结构单元失去一个电子形成酚氧游离基，进而形成醌型结构[9]，醌可以与壳聚糖上的氨基基团产生化学键连接，目前普遍认为醌与氨基通过席夫碱或迈克尔加成反应机理发生共价作用。

鲜切苹果又称轻度加工苹果，是一种具有广阔开发前景的新兴加工产品。与新鲜苹果相比，鲜切苹果由于加工过程中的切分，在贮藏保鲜过程中，更易遭受微生物侵染、发生褐变，导致外观品质下降[10]，营养价值也有不同程度的降低，保鲜难度增加，货架期缩短，大大降低商品价值，因而探索如何防止鲜切苹果品质劣变至关重要。果蔬贮藏品质与其抗氧化能力和抗菌活性密切相关，多数果蔬中含有多糖、萜类、黄酮类、多酚类等具有抗氧化作用的活性物质，能诱导果蔬抗氧化酶系统中与活性氧清除相关酶活性的上升，从而延长果蔬贮藏期。

本文以壳聚糖为原料，采用漆酶催化壳聚糖与没食子酸反应，确定产物的接枝率和溶解性能，利用傅利叶红外光谱、核磁共振等谱学表征方法对产物结构进行鉴定。并将其用于处理鲜切苹果，研究鲜切苹果在贮藏期间各项指标变化的情况，从而探索其在食品防腐保鲜中应用价值的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红富士苹果，购于青岛城阳区大润发春阳路店，果实成熟度为八成熟，人工选择成熟度一致，大小适中、无病虫害、无机械损伤的果实。

壳聚糖（脱乙酰度为90.8%），青岛云宙生物科技有限公司；没食子酸，天津市科密欧化学试剂有限公司；漆酶，由米曲霉制得，酶活力1 000 U/g，北京索莱宝科技有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

AR 2140型电子分析天平，奥豪斯国际商贸有限公司；81-2型恒温磁力搅拌器，国华电器有限公司；pH计，瑞士METTLER TOLEDO公司；真空循环水式真空泵，郑州科工贸有限公司；真空冷冻干燥机，Christ Alpha 1-2 LD plus，德国Marin Christ公司；透析袋，北京索莱宝科技有限公司，截留分子量8 000～14 000 Da；傅利叶红外光谱仪，美国Thermo公司；CT3-4500质构分析仪，美国BROOKFIELD公司；阿贝斯折光仪，上海精密科学仪器有限公司；Anke TGL-16C高速台式离心机，上海安亭科技仪器厂；HH-501电热恒温水浴锅，龙口市先科仪器有限公司；TU-1810紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；傅利叶红外光谱仪，美国Thermo公司；X-射线多晶衍射仪，德国布鲁克Axs有限公司；500 MHz超导核磁共振波谱仪，瑞士布鲁克公司。

1.3 试验方法

1.3.1 壳聚糖没食子酸衍生物的制备

根据前期试验条件，将1.0 g壳聚糖粉末溶于100 mL pH值为4.5的0.1 mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，磁力搅拌器中搅拌至完全溶解后再加入2.8 g没食子酸，溶解完全后加入漆酶（4 U），于25 ℃气浴摇床中反应5 h，反应完成后加300 mL无水乙醇醇沉24 h，布氏漏斗抽滤，将产物溶于超纯水中，透析24 h，每隔8 h换一次水，−40 ℃下真空冷冻干燥后得到壳聚糖没食子酸衍生物（chitosan-gallic acid，CTS-GA）。

1.3.2 接枝率的测定

用线性电位滴定法测定。

根据反应前后自由氨基含量的变化即可测得接枝率，即

式中为空白CTS的脱乙酰度（自由氨基含量）；0为CTS对照样（缓冲溶液处理样）的脱乙酰度；1为CTS-GA的脱乙酰度（游离氨基含量）。

1.3.3 溶解度测定

取20 mg干燥至恒定质量的CTS-GA于锥形瓶中，37 ℃的气浴摇床中震荡溶解24 h，肉眼观察溶解情况，将不溶解的样品过滤干燥后称质量，比较前后质量差，计算溶解度。

式中0为衍生物原干燥质量，g；W为溶解时间时衍生物干燥质量，g。

1.3.4 红外光谱分析

将CTS、GA和CTS-GA完全干燥，称取样品1 mg，与100 mg干燥的KBr在玛瑙研钵中研磨，研细混匀。将研好的粉末均匀放入压膜器中，抽真空加压制得透明薄片，用红外光谱仪测定其红外光谱，不加样品的KBr薄片进行空白实验调整基线，扫描范围为500～4 000 cm-1，扫描次数32次，研究衍生物中没食子酸与壳聚糖的结合情况。

1.3.5 核磁共振波谱分析

取适量的CTS、GA和CTS-GA溶于D2O中，500 MHz频率照射，20 ℃下超导核磁共振波谱仪记录图谱。

1.3.6 材料处理

将苹果清洗去皮，用不锈钢刀切分成5 mm厚薄片，不锈钢刀用浓度为200mol/L的次氯酸钠溶液浸泡2 min后用蒸馏水清洗，晾干。各保鲜剂配置方法见表1（由于没食子酸溶液较易氧化褐变影响鲜切苹果颜色，感官上失去商品价值，所以本文中未将没食子酸处理作为对照组），选择大小及规格一致的鲜切苹果片，随机分成4组，分别浸泡于表1各保鲜剂配方中2 min后取出沥干，对照组在去离子水中同样浸泡处理，分装于市购的PE保鲜袋中，置于(14±1.0) ℃恒温库（与超市鲜切果蔬销售展示柜温度相同）中贮藏，每天测定各项指标。

1.3.7 指标测定

硬度的测定：采用CT3-4500质构分析仪测定，参考文献[11]的方法，选取测试参数：预压速度2.0 mm/s、下压速度0.5 mm/s和压后上行速度0.5 mm/s，触发点负载为6.8 g，探头测试距离4.0 mm。

维生素C含量的测定：采用2,6-二氯酚靛酚滴定法[12]。

表1 鲜切苹果处理方法

多酚含量的测定：采用福林酚比色法[13]。

还原型谷胱甘肽含量（glutathione，GSH）的测定：采用DTNB法。

多酚氧化酶（polyphenoloxidase，PPO）、过氧化物酶（peroxidase，POD）的测定：参照曹建康[14]的方法。以每克样品每分钟吸光度变化0.001为1个多酚氧化酶酶活力单位；以每克样品每分钟吸光度变化0.01为1个过氧化物酶酶活力单位。

过氧化氢酶（catalase，CAT）的测定：参照高俊凤[15]的方法。以每克样品每分钟吸光度变化0.001为1个过氧化氢酶酶活力单位。

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的测定：采用邻苯三酚自氧化法[16]。在每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%的酶量为1个超氧化物歧化酶酶活力单位。

菌落总数的测定，参考GB 4789.2-2010食品安全国家标准-食品微生物学检验-菌落总数测定[17]，采用平板计数法，活菌数用CFU/g表示。

1.4 数据处理

每组试验重复3次，采用Origin 8.5绘图，SPSS 19.0进行方差分析和显著性分析，<0.05表示差异有显著变化，<0.01表示差异有极显著变化。

2 结果与分析

2.1 CTS-GA的接枝率和溶解性

接枝率是指壳聚糖进行接枝反应生成壳聚糖衍生物时，氨基被接枝的比例，采用线性电位滴定法对产物进行滴定。结果表明，壳聚糖没食子酸衍生物的接枝率为72.80%±0.96%，溶解度为92.77%±2.50%。

2.2 CTS-GA的结构表征

2.2.1 红外光谱分析

图1所示，CTS和CTS-GA都在3 419cm-1处出现了一个宽峰，是-OH基的伸缩振动峰[18]，对比原料CTS，CTS-GA的峰强度有所增加，这表明CTS-GA中羟基的量有所增加，CTS-GA在1 384、1 353 cm-1处出现O-H的面内变形振动[18]以及1 149 cm-1处出现的C-O伸缩振动[18]能进一步证明-OH的存在，同时CTS-GA在737 cm-1处形成了一个与GA相类似的峰，该峰为O-H的面外弯曲振动所致[19]，这与-OH的引入密切相关，而CTS-GA在1 702 cm-1处并未出现-COOH的特征峰[20]，这说明在CTS引入的基团中并不含有GA中的-COOH，GA分子中的-COOH可能全部参与了接枝反应，而CTS能与GA的-COOH发生反应的基团包含-OH和-NH2，与原料CTS相比，CTS-GA在1 260 cm-1处并未出现C-NH2吸收峰[20]，即CTS-GA分子中不存在-NH2，说明CTS与GA发生反应时，CTS分子中的C-N键全部断裂与GA中的-COOH反应，发生迈克尔加成反应，以酰胺键结合，CTS-GA在1 600 cm-1处出现的酰胺键特[20]征峰印证了该假设。CTS-GA在1 600 cm-1处的吸收峰减弱，表明壳聚糖主链引入了苯基，并且壳聚糖原料中的-NH2减少；878 cm-1处出现的糖环伸缩振动吸收峰[20]说明CTS与GA的反应并没有改变壳聚糖的骨架。以上分析表明，CTS与GA反应以酰胺键结合，且反应并未改变壳聚糖的骨架结构。

2.2.2 核磁共振波谱分析

用1H-NMR分析技术进一步确定CTS-GA与原料CTS分子的结构是否存在差异。CTS、GA及CTS-GA结构单元上的主要质子信号如图2所示，CTS氢谱表明，=1.99处的吸收峰是D2O的存在引起的，=2.99处的峰归因于H-2的存在，=3.53～3.72区间的吸收峰属于H-3，H-4，H-5，H-6，=4.75处吸收峰则属于H-1的作用[21]。经对比分析，=3.11～3.84 之间的信号峰是由于CTS-GA分子中H-2～H-6振动引起的，CTS-GA在低场=7.08处出现了苯环质子的信号峰[22]，=4.88处出现了酚羟基的质子峰[22]，这两个峰的出现说明CTS-GA分子存在GA的苯环结构，能够证实GA与CTS发生了接枝反应，低场=1.10～1.19为醇羟基归属峰[23]，且该峰的积分面积与CTS相等，说明CTS分子C3和C6位醇羟基未参与接枝反应，以上谱图结果表明，GA成功接枝到CTS分子链上，在C2位发生迈克尔加成反应形成酰胺键。

2.3 CTS-GA对鲜切苹果的保鲜作用

2.3.1 CTS-GA对鲜切苹果理化品质的影响

在果实贮藏期间，由于纤维素和果胶的分解加之水分的蒸发，导致果实硬度下降，果实硬度反映了果实的成熟与衰老。由图3a可以看出，若鲜切苹果的硬度小于6N就被判定失去商品价值[24]，则CK组苹果在第4天就失去了商品价值，而CTS-GA处理的苹果贮藏至第6天才失去商品价值。随着贮藏时间的延长，各试验组的果肉硬度逐渐降低。CK组硬度由初始的7.32N下降至第4天的5.79N，下降了20.9%，CTS和CTS.GA处理贮藏至第4天时硬度分别下降16.6%、15.6%，而10mg/mL CTS-GA处理的苹果硬度损失率仅为10.23%，比CK、CTS和CTS.GA分别低20.90% (<0.05)、16.60% (<0.05)和15.60% (<0.05)，并且用CTS-GA处理的鲜切苹果贮藏至第6天时，硬度仅下降18.0%，下降程度低于贮藏至第4天的CK处理（<0.05），说明CTS-GA能有效地减缓果实的软化速度，推测是因为CTS-GA能减少水分蒸发，抑制腐败菌繁殖[25]，使得维持果实硬度的纤维素和果胶分解速度降低，从而保持果实硬度。

苹果受到切割损伤后，由于缺乏相应的保护机制，呼吸作用瞬间加强，达到呼吸高峰，消耗大量可溶性固形物，因此各组处理的可溶性固形物含量均出现一定程度的降低，由图3b可以看出，可溶性固形物含量除CK组在贮藏期间呈逐渐下降趋势外，其他3组均出现一定程度的波动。贮藏第4天，CTS-GA处理可溶性固形物含量为12.93%，明显高于CK处理16.47%（<0.01），CTS与CTS.GA物理复合物处理差异并不显著（>0.05）。贮藏后期CTS和CTS.GA物理复合物处理可溶性固形物含量出现明显上升可能是由于组织严重失水，干缩造成的。在整个贮藏期间，CTS-GA处理的可溶性固形物含量始终高于其他3组且下降速度最缓慢（<0.05），可能是由于CTS-GA在一定程度上抑制了鲜切苹果的生理代谢，使其呼吸消耗作用减弱[26]。因此，CTS-GA可有效降低鲜切苹果的可溶性固形物的消耗，保持其贮藏特性。

维生素C不但是果实的重要营养成分之一，同时也是清除果实内活性氧的重要抗氧化剂。由图3c可知，各处理苹果的维生素C因被氧化分解造成其含量逐渐减少，各处理维生素C含量均高于CK处理，但CTS-GA处理的维生素C含量始终处于最高水平（<0.05），14 ℃下贮藏4天后，10mg/mL衍生物处理的苹果维生素C含量为1.23 mg/(100 g)，高于CK处理48.78% (<0.05)，较好的抑制了维生素C含量的下降，对维持鲜切苹果的营养物质起到了有效的作用，这可能归因于CTS-GA分子中含较多的酚羟基，酚羟基对维生素C具有保护作用[27]，可以减缓果实维生素C的氧化进程。

还原型谷胱甘肽（GSH）作为抗坏血酸-谷胱甘肽循环中的重要中间物质，可通过提高超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）等酶活性、增加抗坏血酸的含量，与抗坏血酸协同作用发挥抗氧化作用；也可通过清除自由基生成氧化型谷胱甘肽，从而阻止膜脂过氧化[28]。由图3d可以看出，各处理组鲜切苹果GSH含量在贮藏期间都呈现整体下降趋势，可能的原因是，GSH的前体物质-抗坏血酸在贮藏过程中不断消耗，从而使GSH含量在贮藏期间降低。与抗坏血酸相比，国内外对于鲜切果蔬中GSH的研究和报道较少。CK处理的GSH始终低于其他3组处理，贮藏至第4天时，CK处理的GSH质量分数为4.7mg/(100 g)，而CTS-GA处理的GSH质量分数达到了6.26 mg/(100 g)，高于CK处理24.92%，存在显著差异（<0.05），CTS.GA物理复合物处理与CTS处理效果无显著差异（>0.05），但与CK处理差异显著（<0.05），说明3组处理均能维持GSH含量，抵御活性氧的侵害，CTS-GA处理效果最佳。

由图3e所知，在整个贮藏过程中，酚类物质呈缓慢下降的趋势。在贮藏至第1天，处理组就与CK组呈现显著差异（<0.05），其中CTS-GA处理的鲜切苹果的多酚类物质下降最为缓慢，在贮藏至第4天时，多酚含量为6.24 mg/(100 g)，高于CK处理43.75% (<0.05)，表明CTS-GA能抑制多酚物质的氧化。

果实处理后品质下降很大程度上是由于受到了微生物的侵染而引起腐烂变质，由图3f可以看出，在整个贮藏期，CTS-GA处理的鲜切苹果微生物数量上升幅度较为平缓，贮藏至第3天时，CK和CTS处理的鲜切苹果菌落总数增长速度明显快于CTS-GA处理，CK与CTS处理在第4天时菌落总数已分别达到了33×104CFU/g和28×104CFU/g，而CTS-GA处理在第4天菌落总数为16.00×104CFU/g，第6天菌落总数仍低于28×104CFU/g，说明CTS-GA处理能很好的抑制鲜切果蔬表面微生物的滋生。

2.3.2 CTS-GA对鲜切苹果衰老相关酶活性的影响

果实褐变是多酚氧化酶和过氧化物酶氧化多酚类底物所引起的一种病理反应。在采后的贮藏过程中，多酚氧化酶（PPO）活性与果实的褐变密切相关，PPO能催化多酚氧化生成黑色素，影响外观品质。由图4a可知，在贮藏过程中，CTS-GA组的PPO活性始终低于其他3组，贮藏至第4天时，CTS-GA组多酚氧化酶活性比CK低36.73% (<0.05)，由于PPO能够催化酚类底物发生酶促褐变，因此CTS-GA处理能有效减轻鲜切苹果在贮藏期间的酶促褐变程度，这可能是由于CTS-GA分子中含有的酚类还原物质起到了主要的抗氧化作用，在鲜切苹果表明形成一层抗氧化的保护膜[29]，建立保护屏障，避免了空气中O2的氧化作用。

有研究表明，许多果蔬组织中的过氧化物酶（POD）活性都伴随着机械伤害而上升，并且还产生新的POD同工酶[30]。如图4b所示，在整个贮藏期，CK组的POD活性一直高于其他3组处理（<0.05），贮藏4 d时，CK组POD活性达到了11.01 U/(g·min)，而CTS-GA组POD活性比CK组低76.94% (<0.05)，这说明CTS-GA能有效抑制POD酶活性，降低切分对苹果造成的损伤。

超氧化物歧化酶（SOD）是果实后熟衰老过程中保护性酶类，能够清除植物体内过量的活性氧，从而在一定程度上延缓果实的衰老过程。过氧化氢酶（CAT）能催化植物体内积累的过氧化氢分解为水和氧，从而减少过氧化氢对果蔬组织可能造成的伤害。由图4c和4d可知，SOD活性和CAT活性的总体趋势为先升高后降低。在贮藏前期，CK组CAT活性高于其他3组处理（<0.05），SOD活性在贮藏前期出现跃变式上升，CTS处理和CTS.GA物理复合物处理SOD值在第一天达到最大值，分别为23.7 U/(mL·min)、16.8 U/(mL·min)，CK最大值推迟一天出现，贮藏后期，SOD活性和CAT活性下降，CK组活性氧清除能力减弱，而CTS-GA处理SOD活性和CAT活性升高，说明CTS-GA可有效提高SOD和CAT保护酶活性，增强活性氧的清除能力，从而减少对膜的损伤，提高抗衰老能力，从而延长果实货架期。

2.4 成本分析与应用成本

目前关于壳聚糖衍生物作为食品保鲜剂的研究大部分仅限于实验室，在将其应用于商业化生产方面缺乏相关报道。本项目产品的主要原料为壳聚糖、没食子酸、漆酶和无水乙醇等，食品级壳聚糖和没食子酸参考价格分别为200元/kg和100元/kg左右，其中漆酶添加量极少，成本可忽略，无水乙醇可以回收反复利用。根据前期试验结果，每千克壳聚糖和没食子酸原料可以生产衍生物0.5 kg，配制保鲜液50 L。按1 L保鲜液可处理100～150 kg鲜切果蔬计，即鲜切果蔬需要衍生物原料的成本为0.04～0.06元/kg；另计衍生物生产所消耗的水、电、生产资料及人工费用0.20元/kg左右，所以每千克鲜切果蔬所需保鲜剂成本为0.25元/kg左右。根据上述计算方法，使用壳聚糖进行保鲜的成本为0.12元/kg左右，壳聚糖没食子酸物理复合物的保鲜成本为0.15元/kg左右。虽然衍生物使用成本略高于其他处理，但是根据试验结果，衍生物处理可减少鲜切果蔬损失30%以上，可挽回经济损失数十元，经济效益可观，具有实际应用价值。

壳聚糖没食子酸酶法合成衍生物操作工艺简单，设备投资少，并且该衍生物作为生物保鲜剂可生物降解，对环境无污染，因此适用于鲜切果蔬的运输和销售，具有巨大的工业化生产潜力和广阔的应用前景。在后续研究中可以对衍生物制备工艺进一步优化，使其更适用于工业化的批量生产。

3 结 论

1）以没食子酸为小分子配体，漆酶为催化剂，对壳聚糖进行改性，反应条件温和，得到的衍生物接枝率为72.80%±0.96%，溶解度为92.77%±2.50%。光谱学分析结果表明，没食子酸分子中的羧基与壳聚糖分子氨基上发生了迈克尔加成反应，在壳聚糖的C2位生成酰胺键。

2）壳聚糖没食子酸衍生物(CTS-GA)对鲜切苹果的保鲜试验结果表明，14 ℃下贮藏4d后，10 mg/mL衍生物处理的苹果硬度损失率仅为10.23%，比对照（CK）、壳聚糖（CTS）和壳聚糖没食子酸物理复合物（CTS.GA）分别低20.90% (<0.05)、16.60% (<0.05)和15.60% (<0.05)；可溶性固形物、维生素C、谷胱甘肽和多酚含量分别为12.93%，1.23 mg/(100 g)，6.26 mg/100g和6.24 mg/(100 g)，分别高于CK16.47% (<0.05)，48.78% (<0.05)，24.92% (<0.05)和43.75% (<0.05)；多酚氧化酶和过氧化物酶活性分别比CK低36.73% (<0.05)和76.94% (<0.05)；菌落总数为16.00 ×104CFU/g，显著低于CK、CTS和CTS.GA处理组(<0.05)。说明CTS-GA可有效抑制过氧化物酶和多酚氧化酶活性，减少可溶性固形物、维生素C和多酚含量的损失，提高超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性，很好的保持其色泽，抑制微生物的生长。

3）壳聚糖没食子酸酶法合成衍生物成本低廉，每千克鲜切果蔬所需衍生物成本仅为0.25元/kg左右，保鲜效果显著，可减少鲜切果蔬损失30%以上，操作简单。

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Enzymatic synthesis of chitosan-gallic acid derivative and its preservation effect on fresh-cut apple

Wu Hao1, Zhen Tianyuan1, Chen Cunkun2, Wang Yiying1, Luo Dan1, Zhang Xiao1, Wang Chengrong1※

(1.266109,; 2.300384,)

In order to broad the application scope and improve the preservation effect of chitosan (CTS) and gallic acid (GA), CTS derivative with GA was synthesized by laccase catalysis method. The grafting rate and solubility, structural characterization and preservation effect of derivative on fresh-cut apple were investigated. Results showed that the grafting rate and solubility were respective 72.80% and 92.77%. The preliminary characterization of derivative was studied through a series of testing methods including ultraviolet spectrum, FTIR (Fourier transform infrared spectroscopy), X-ray diffraction spectra and superconducting magnetic resonance spectrum. Ultraviolet spectrum analysis result showed that benzene ring and auxochrome -OH were introduced into CTS molecules. FTIR result showed that -NH2of CTS molecules decreased, which reacted with GA by amid linkage and did not change the main chain structure of CTS. X-ray diffraction analysis result indicated that with the addition of GA, CTS conformation was changed, a new kind of crystal was formed gradually, the area of amorphous area increased, the order of the structure reduced, the intermolecular and intramolecular hydrogen bonding in polymer were destroyed, and the crystallinity of CTS reduced.13C-NMR (nuclear magnetic resonance) analysis result demonstrated that CTS-GA exhibited the resonance absorption peak of C=O.1H-NMR analysis result proved that CTS-GA exhibited the benzene ring and alcoholic hydroxyl proton peaks. All above analysis results confirmed the successful grafting of GA onto CTS. The conjugation of GA onto CTS probably occurred between amine (C-2) and carboxyl groups of GA, forming amide linkage. Effects of chitosan (CTS), derivative of chitosan and gallic acid (CTS-GA), physical compound of chitosan and gallic acid (CTS.GA) and deionized water (CK) treatment on fresh-cut apples’ biochemical properties, such as hardness, soluble solid, polyphenol, vitamin C, glutathione (GSH) content, activities of polyphenol oxidase (PPO), peroxidase (POD), superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and total number of bacteria colony. Analytical determinations were made every day. After 4-day storage at 14 ℃, the loss of hardness of CTS-GA group was only 10.23%, which was significant lower than those of CK (20.90%), CTS (16.60%) and CTS.GA (15.60%). The soluble solid, vitamin C, GSH and polyphenol content of CTS-GA group were 12.93 %, 1.23 mg/100g, 6.26 mg/100g and 6.24 mg/100g, which were 16.47%, 48.78%, 24.92% and 43.75% respectively higher than those of CK, while the activity of PPO and POD of CTS-GA group were 36.73% and 76.94% lower than CK treatment. And the amount of microorganism in CTS-GA group was 16.00×104CFU/g, obviously lower than CK, CTS and CTS.GA groups. These results suggested appropriate CTS-GA treatment provided better maintenance of hardness, effectively reduced the loss of vitamin C, soluble solid content, polyphenol content and GSH, inhibited the PPO activities, and also maintained higher activity of SOD and CAT, and suppressed the microbial growth. Therefore CTS-GA treatment can delay the senescence rate and exert an excellent effect on fresh keeping of fresh-cut apple. The results clearly indicate that enzyme-mediated pattern of CTS and GA can provide a novel ‘green’ pathway of preparing and broaden the application fields of CTS and GA such as food preservation industry.

storage; quality control; fruits; chitosan; gallic acid; laccase; preservation

10.11975/j.issn.1002-6819.2017.04.039

TS255.3

A

1002-6819(2017)-04-0285-08

2016-08-01

2017-01-20

国家自然基金青年基金（31401549）；山东省现代蔬菜产业技术体系（SDAIT-05-21）；山东省农业重大应用技术创新项目子课题（SDNYCX-2015-ZD06-02）；山东省高等学校科技计划项目（J14LE11）；青岛市科技计划项目（14-2-4-71-jch）；青岛农业大学高层次人才科研基金（1207）。

吴昊，女，黑龙江人，副教授，博士，研究方向为果蔬加工与贮藏。青岛 山东省青岛市青岛农业大学食品科学与工程学院，266109。 Email：wuhaoqau@163.com

王成荣，男，山东人，教授，研究方向为果蔬加工与贮藏。青岛 山东省青岛市青岛农业大学食品科学与工程学院，266109。 Email：qauwcr@126.com

吴 昊，甄天元，陈存坤，王艺颖，罗 丹，张 潇，王成荣. 壳聚糖没食子酸衍生物酶法制备及对鲜切苹果的保鲜效果[J]. 农业工程学报，2017，33(4)：285－292. doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2017.04.039 http://www.tcsae.org

Wu Hao, Zhen Tianyuan, Chen Cunkun, Wang Yiying, Luo Dan, Zhang Xiao, Wang Chengrong. Enzymatic synthesis of chitosan-gallic acid derivative and its preservation effect on fresh-cut apple[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2017, 33(4): 285－292. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2017.04.039 http://www.tcsae.org