强 胜,杜珍芳,黄 敏,马晓伟,周奕岑

(江苏省张家港市中医医院,江苏 张家港,215600)

益气养阴通络方对IgA肾病模型大鼠肾脏组织肿瘤坏死因子-α的影响

强 胜,杜珍芳,黄 敏,马晓伟,周奕岑

(江苏省张家港市中医医院,江苏 张家港,215600)

目的探讨益气养阴通络方对IgA肾病模型大鼠血尿、蛋白尿及对其肾脏组织病理的影响。方法60只雄性清洁级SD大鼠，随机分为空白组、模型组、黄葵组与中药(益气养阴通络方)高、中、低剂量组，于造模前及造模后第4、8、12、16周末对各组大鼠24 h尿蛋白定量、尿红细胞计数进行检测，同时给药后8周分别通过HE染色法、免疫组化法检测各组大鼠肾组织病理变化及TNF-α表达情况。结果与空白组比较，模型组、黄葵组、中药高、中、低剂量组大鼠给药8周后尿红细胞计数、24 h尿蛋白、TNF-α表达均不同程度增高(P<0.05);与模型组比较，黄葵组、中药高、中、低剂量组给药8周后尿红细胞计数、24 h尿蛋白、TNF-α表达显著降低(P<0.05),且中药组给药8周上述指标均显著低于黄葵组(P<0.05)。光镜显示空白组大鼠肾组织结构正常，模型组大鼠多数肾小球系膜细胞和基质出现中、重度增生，肾间质出现炎性细胞浸润伴灶状纤维化;各治疗组肾小球系膜细胞和系膜基质增生程度均有一定程度缓解。结论益气养阴通络方可减少IgA肾病模型大鼠血尿、蛋白尿，减轻肾脏组织病变，其作用机制可能与其降低尿红细胞数、24 h尿蛋白，抑制肾脏TNF-α表达有关。

IgA肾病;益气养阴通络方;机制;TNF-α

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the effect of yiqi yangyin tongluo regime on hematuria,proteinuria and renal tissue′s pathological changes in rats with IgA nephropathy (IgAN).MethodsSixty clean male SD rats were randomized into blank group,model group,huangkui group and high,medium and low-dose TCM (yiqi yangyin tongluo regime) group.After modeling for 0 week,4 weeks,8 weeks,12 weeks and 16 weeks,the levels of urine red blood cell count and 24 h urine protein were detected.Meanwhile,after feeding for 8 weeks,the pathological changes of remnant renal tissues and expression of TNF-α were detected by HE staining and immunohistochemical staining.ResultsAfter feeding for 8 weeks,compared with blank group,the level of urine red blood cell count,24h urine protein and TNF-α expression in model group,huangkui group,high,medium and low-dose TCM group were significantly higher (P<0.05).Compared with the model group,the level of urine red blood cell count,24h urine protein and TNF-α expression in huangkui group,high,medium and low-dose TCM group were significantly lower (P<0.05).The above indexes in TCM group were significantly lower than huangkui group (P<0.05).Light microscopy showed that the renal tissues were normal in blank group.In the model group,most of glomerular mesangial cells and matrix appeared moderate and severe hyperplasia,inflammatory cells and focal fibrosis were seed in renal interstitium.Proliferation of mesangial cells and matrix were relieved in huangkui group and TCM group.ConclusionYiqi yangyin tongluo regime can effectively ameliorate the levels of urine red blood cell count,24 h urine protein and renal pathological changes.The mechanism may be related to the decrease of urine red blood cell count and 24 h urinary protein,and inhibition of TNF-α expression.

KEYWORDS:IgA nephropathy;yiqi yangyin tongluo regime;mechanism;TNF-α

IgA肾病(IgAN)在中国十分常见，是一组以IgA或IgA为主的免疫复合物在肾小球系膜区沉积为特征的原发性肾小球疾病。研究[1]发现25%～50%的患者在确诊IgA肾病后的 10～20 年内可发展至终末期肾病。目前IgA 肾病的治疗[2]以对症及免疫抑制为主，主要包括ACEI/ARB的使用、糖皮质激素、免疫抑制剂、扁桃体摘除术等。本研究探讨益气养阴通络方对IgA肾病模型大鼠的治疗效果及其机制，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性清洁级SD大鼠60只，体质量180～220 g,由南京医科大学动物实验中心提供，动物生产许可证号为SCXK(沪)2014-0001。所有大鼠实验前均适应性喂养1周，饲养环境为清洁级实验动物房，定时给予普通清洁级动物饲料，室温22～25 ℃,湿度50%～70%,光照、黑暗时间各12 h。

1.2 药品及试剂

益气养阴通络方:太子参15 g,炙黄芪15 g,熟地10 g,生地10 g,海风藤15 g,鸡血藤15 g,青风藤15 g,全蝎粉1.5 g,由张家港市中医院制剂室制成口服液;黄葵胶囊，购自江苏苏中药业集团股份有限公司;葡萄球菌肠毒素B(SEB)购自解放军军事医学科学院微生物研究所;牛血清白蛋白(BSA)、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂购自美国Sigma公司;兔抗大鼠异硫氰酸标记的IgA抗体购自北京博奥森生物技术有限公司;大鼠TNF-α试剂盒购自南京森贝伽生物科技有限公司。

1.3 分组与建模

雄性清洁级Wistar大鼠60只，适应性喂养1 周后，用代谢笼收集检测尿蛋白和潜血均为阴性，按随机数字表法分为空白组、模型组、黄葵胶囊组、YYTF高、中、低剂量组各10只。参考文献[3]方法造模:从实验第1天起以 BSA 200 mg/kg(配成水溶液)隔日灌胃，共12周;于实验第1天皮下注射完全弗氏佐剂0.2 mL(含BSA 2 mg),第14、28天经腹腔注射不完全弗氏试剂0.2 mL(含BSA 2 mg);第8～10周每周从尾静脉注射SEB 0.4 mg/kg(用0.9% NaCl 配成水溶液共0.5 mL)。

1.4 给药方式

60只大鼠采取灌胃给药。从实验造模的第9周起，空白组、模型组给予同体积蒸馏水灌胃，黄葵组及中药组按照大鼠体质量(g)与药物(mL)对照表给药，每日给药前均称量大鼠体质量，按体质量变化增减给药剂量，共治疗8周。益气养阴通络方(YYTF)常规煎煮，过滤收集煎液，经旋转蒸发仪浓缩至含生药2 g/mL的浓缩液，分别抽取32.4 mL(含生药64.8 g),64.8 mL(含生药129.6 g)和129.6 mL(含生药259.2 g)的浓缩液，加蒸馏水至200 mL,混匀配置YYTF 3个剂量组，即低剂量(YYTF1)、中剂量(YYTF2)和高剂量组(YYTF3)。期间大鼠自由进食、饮水。

1.5 标本采集及检测

① 观察饮食、尿量、精神状态、毛色、体质量等一般情况。② 分别于造模前及造模后第4、8、12、16周末代谢笼收集24 h尿液，检测24 h尿蛋白定量(24 h-UTP)、尿红细胞计数。③ 血液、肾脏标本采集。标本采取前，所有大鼠均禁食12 h，禁水4 h。用戊巴比妥钠按每1～2 mL麻醉后，开腹穿刺腹主动脉取血4～5 mL,迅速摘取双肾，用生理盐水冲洗，除去非肾脏组织，观察肾脏形态。取一侧肾脏投入4%多聚甲醛溶液固定。④ TNF-α的测定。肾组织HE染色，取材、固定、洗涤、脱水、透明、透蜡、包埋、切片、展片、贴片、脱蜡复水、染色、水洗、分化、漂洗、脱水、复染、脱水、透明、中性树胶封存，显微镜下观察各组肾脏组织切片特点。采用ELISA法测定TNF-α的表达。

2 结 果

2.1 大鼠一般情况观察

实验结束时，模型组大鼠死亡 2 只，黄葵组死亡 1 只，其余各组均无死亡。空白组大鼠一般状态较好，其余各组大鼠自第7周开始出现不同程度的精神不振、毛色萎黄、食欲及体质量下降、皮下水肿及尿色改变。各治疗组给予药物治疗后，上述症状于1～2周逐渐缓解。其中YYTF组缓解最快，模型组缓解最慢。

2.2 尿红细胞及24 h尿蛋白定量检测

2.2.1 各组大鼠尿红细胞计数的比较:在实验过程中，空白组大鼠尿液中未检测出红细胞。其余各组在第8周末开始出现肉眼血尿及镜下血尿，与空白组比较，差异有统计学意义(P<0.05);至12周末，各治疗组尿红细胞计数比模型组减少，差异有统计学意义(P<0.05),但仍显著高于空白组(P<0.05);各YYTF组与黄葵组相比，尿红细胞计数显著减少(P<0.05),YYTF组下降更为明显;至16周末，各组大鼠尿红细胞计数明显减少,YYTF高、中剂量组与模型组相比，差异显著(P<0.01)。见表1。

表1 各组大鼠各周末尿红细胞计数的比较个

与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01;与黄葵组相比,#P<0.05;与空白组比较,△P<0.05。

2.2.2 各组大鼠24 h尿蛋白检测:在实验过程中，空白组大鼠未出现蛋白尿。其余各组在第8周末开始出现蛋白尿，与空白组比较，差异有统计学意义(P<0.05);至12周末，各治疗组尿蛋白比模型组减少，差异有统计学意义(P<0.05),但仍显著高于空白组(P<0.05);各YYTF组与黄葵组相比，尿蛋白减少，但差异无统计学意义(P>0.05);至16周末，各组大鼠尿蛋白减少，各YYTF组与黄葵组相比尿蛋白减少，差异有统计学意义(P<0.05),各治疗组疗效与药物浓度呈正相关。见表2。

表2 各组大鼠24 h尿蛋白检测 mg/24 h

与空白组比较,*P<0.05;与黄葵组相比,#P<0.05;与模型组比较,△P<0.05。

2.3 肾组织切片光镜观察

光镜下见空白组大鼠肾组织结构正常;模型组大鼠肾间质出现淋巴细胞、单核细胞浸润伴灶状纤维化，多数肾小球系膜细胞和基质出现中重度增生、球囊黏连、毛细血管受压、足细胞肿胀;各治疗组肾小球系膜细胞和系膜基质增生程度均有不同程度缓解，系膜细胞数较模型组明显减少，足细胞无明显肿胀。

2.4 ELISA法测定TNF-α的表达

按照ELISA试剂盒操作步骤，测定系列含不同浓度TNF-α标准品溶液的OD值，绘制标准曲线，得线性方程回归y=79.822χ2+190.09χ+1.9701,r=0.9999。表示标准品在1000～15.625 pg/mL范围内线性关系良好。

再测定样本的OD值，依据回归方程计算样本浓度，造模后各组大鼠血清TNF-α的含量明显升高。治疗后，各治疗组与模型组相比血清TNF-α的含量显著下降(P<0.05);提示IgA 肾病模型大鼠血清TNF-α与病情成正相关;与黄葵组相比，各中药治疗组血清TNF-α下降程度更为显著(P<0.05),说明益气养阴通络治疗在降低血清TNF-α方面疗效更明显，见表3。

表3 各组大鼠TNF-α表达的比较 pg/mL

与空白组比较,*P<0.05;与黄葵组相比,#P<0.05;

与模型组比较,△P<0.05。

3 讨 论

IgA肾病是中国最常见的肾小球疾病，占所有原发性肾小球疾病的45%～50%[4]。既往认为IgA肾病预后良好，现发现25%～50%的患者在确诊IgA肾病后的10～20年内可发展至终末期肾病。IgA肾病的发病机制尚未完全明确，治疗方案以ACEI/ARB类药物、免疫抑制剂为主，有一定疗效，但毒副作用不小。

现有研究[5-6]认为IgA肾病的发病机制与免疫复合物在肾小球系膜区沉积、炎症反应的触发及遗传因素相关。目前研究[7-8]认为IgA肾病的典型病理改变是IgA1的沉积，由此推测IgA肾病发生的中心环节是形成IgA 免疫复合物。已有大量证据[9]表明，沉积在肾小球系膜区的免疫复合物主要为多聚IgA1。IgA1发生异常糖基化，出现O型寡糖链半乳糖基化降低、N-乙酰半乳糖胺增加，可促使IgA1在肾小球系膜区的沉积，从而加速肾小球的损伤[10]。IgA1与系膜细胞接触后能触发炎症性瀑布样反应，促使系膜细胞分泌血小板活化因子、白细胞介素-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及巨噬细胞移动抑制因子(MIF)，从而引起单核细胞趋化蛋白1、IL-8、IL-10的释放，进一步放大炎症反应，加重肾小球损伤。TNF-α是其中的一个重要的促炎因子和免疫调节因子，参与了IgA肾病的发病过程[11]。TNF-α通过影响肾小球系膜细胞(GMC)的功能，改变细胞形态和细胞骨架，并刺激GMC 增殖、表达黏附分子以及成纤维细胞增生，从而导致肾脏发生纤维化[12]。TNF-α 还能通过激活转录因子蛋白介导路径促使炎性介质在GMC以及血管内皮细胞上进行表达，从而造成自分泌强化回路，加重炎症损伤，加快炎症发生、发展速度[13]。

IgA肾病病程长，迁延不愈，易病情反复，患者长期尿检红细胞、蛋白不易消失。中医学认为IgA肾病的基本病因病机为感受外邪或湿热损伤血络或瘀血阻于肾络，加之脾虚失其统摄、肾虚失其封藏，导致精微物质下泄，出现蛋白尿、血尿。本课题组将中医经络理论与现代医学肾脏组织结构、生理、病理及微循环障碍学说相结合，提出慢性顽固性肾病有络脉空虚、络脉瘀阻两大特征，从而制定了益气养阴、导滞通络的治疗原则。络脉在人身内三维立体，网络分布，为脏腑内外整体性协调联系的重要结构，是构成人体内外环境的物质基础。其中络脉中之阴络满溢灌注双向流动的特征，与肾小球密布毛细血管网有相似之处。本课题组前期研究表明，补虚和络、治伤止血标本兼治，能修复损伤的肾小球，可显著改善实验室指标。本科多运用益气药物如黄芪及重用以虫类药为主的活血化瘀通络药物，再根据长期临床疗效观察，创立了益气养阴通络方(由炙黄芪、太子参、熟地、生地、青风藤、海风藤、鸡血藤、全蝎组成)。方中以黄芪为君重在益气，太子参、生熟地为臣主以养阴，加之青风藤等藤类药及全蝎活血通络，共奏益气养阴、活血通络之功。现代药理[14]证明，黄芪具有增加肾脏血流量，减少肾小球IgA的沉积及蛋白尿的功效。地黄提取物[15-16]可有效下调体内TNF-α水平。虫类药及藤类药因其走窜透达、逐瘀破血特性，可以改善肾脏微循环[17-18]。

本研究结果显示，各模型组大鼠血清TNF-α的含量显著高于空白对照组(P<0.05),并且升高程度与病情成正相关，提示TNF-α 的异常增高是导IgA 肾病发病的病理机制之一。治疗后，各组大鼠 24 h尿红细胞计数、24 h-UTP明显降低，同时肾脏组织中的TNF-α的含量也随之下降。YYTF组大鼠的尿红细胞数、蛋白尿情况及TNF-α水平均较黄葵组大鼠明显下降，且疗效与剂量呈正相关，提示益气养阴通络方可显著减轻IgA肾病模型大鼠蛋白尿及血尿，减少TNF-α水平表达，疗效与剂量呈正相关。

[1] LE W,Liang S,Hu Y,et al.Long-term renal survival and related risk factors in patients with IgA nephropathy:results from a cohort of 1155 cases in a Chinese adult population[J].Nephrol DIAL Transplant,2012,27(4):1479-1485.

[2] 王莉,刘杰.IgA肾病的研究进展[J].医学综述,2013,19(15):2778-2781.

[3] 彭伟,刘郑荣.两种IgA肾病大鼠模型的比较[J].南方医科大学学报,2008,28(10):1842-1845.

[4] Zhou F D,Zhao M H,Zou WZ,et al.The changing spectrum of primary glomerular diseases within 15 years:a survey of 3331 patients in a single Chinese centre[J].Nephrol Dial Transplant,2009,24(3):870-876.

[5] Kiryluk K,Li Y,Scolari,et al.Discovery of new risk loci for IgA nephropathy implicates genes involved in immunity against intestinal pathogens [J].N at Genet,2014,46(11):1187-96.

[6] Kiryluk K,Li Y,Scolari,et al.Discovery of new risk loci for IgA nephropathy implicates genes involved in immunity against intestinal pathogens [J].N at Genet,2014,46(11):1187-96.

[7] Boyd J K,Cheung C K,Molyneux K,et al.An update on the pathogenesis and treatment of IgA nephropathy[J].Kidney Int,2012,81:833-843.

[8] Lai KN.Pathogenesis of IgA nephropathy [J].Nat Rev Nephrol,2012,8(5):275-83.

[9] 李振,徐元宏.糖基化异常的IgA1分子与IgA肾病[J].国际检验医学杂志,2014(23):153-157.

[10] Giannakakis K,Feriozzi S,Perez M,et al.Aberrantly glycosylated Ig A1 in glomeru-lar immune deposits of IgA nephropathy[J].JAmSoc Nephrol,2007,18(12):3139-3146.

[11] 刘中柱,孔祥静,刘艳姝,等.黄葵胶囊对慢性肾小球肾炎患者血清 Lkn-1 和 TNF-α 水平影响的研究[J].中国中西医结合肾病杂志,2011,12(1):78-79.

[12] 梁一鸣.黄芪颗粒对Ig A 肾病患者血清中 MCP-1、TNF-α 和 IL-6 水平的影响[J].新中医,2015,47(5):115-117.

[13] 吴金珠.TNF-α在慢性肾小球肾炎中的作用研究[J].辽宁中医药大学学报,2011,13(12):144-145.

[14] 郭文岗,杨爱国.中西医结合治疗中等量蛋白尿 Ig A 肾病临床观察[J].广西中医药大学学报,2013,16 (2):43- 44.

[15] Han Y,Jung H W,Lee J Y,et al.2,5-Dihydroxyacetophenone isolated from Rehmanniae Radix Preparata inhibits inflammatory responses in lipopolysaccharide-stimulated RAW264.7 macrophages [J].J Med Food,2012,15(6):505-510.

[16] Zhang Z,Meng Y,Guo Y,et al.Rehmannia glutinosa polysaccharide induces maturation of murine bone marrow derived Dendritic cells (BMDCs) [J].Int J Biol Macromol,2013,54:136-43.

[17] 陈笛,远方.虫类药在慢性肾脏病中的治疗[J].辽宁中医药大学学报,2014,6(7):167-168.

[18] 刘玉宁,王耀献.藤类药治疗肾小球疾病临床运用体会[J].上海中医药杂志,2012,46( 9):70-71.

EffectofyiqiyangyintongluoregimeonexpressionofTNF-αinrenaltissueinratswithIgAnephropathy

QIANGSheng,DUZhenfang,HUANGMin,MAXiaowei,ZHOUYicen

(ZhangjiagangHospitalofTraditionalChineseMedicine,Zhangjiagang,Jiangsu,215600)

R 692

A

1672-2353(2017)17-064-05

10.7619/jcmp.201717019

2017-04-06

江苏省苏州市科技局基金项目(SYSD2013156)