赵静 朱雅宁 （天津市动物疫病预防控制中心 300402）

畜禽衣原体病水平传播免疫阻断技术应用

赵静 朱雅宁 （天津市动物疫病预防控制中心 300402）

天津地区畜禽衣原体病已广泛存在，给养殖业带来了巨大的经济损失，为有效防控衣原体病的发生，我们对疫苗进行监测和筛选，防止疫苗携带病原感染鸡群，造成衣原体经疫苗水平传播。

衣原体病；疫苗筛选；水平传播阻断技术；应用推广

衣原体 (Chlamydia)是一种多宿主性病原微生物，可感染包括人在内的灵长类动物、家养和野生哺乳动物、禽类及两栖动物。在临床上引起支气管肺炎、结膜炎、肺炎、肠炎等，犊牛、仔猪多表现为肺肠炎，1日龄雏鸡可急性死亡，不死的出现结膜炎、喜蹲卧或呈企鹅姿势站立、腹泻、排绿色稀便。衣原体能在易感畜禽之间通过直接接触或传播媒介(如昆虫、老鼠、风等)的作用传染，并在一定范围内流行。故若能有效阻断水平传播途径，可有效减少衣原体病的传播和发病，为衣原体病的防治提供新的技术途径。

本研究引进中国农业大学提供的 “畜禽衣原体综合防治技术与应用研究”项目中的衣原体水平传播阻断技术，对天津畜禽养殖场使用的疫苗进行监测和筛选，防止疫苗携带病原感染鸡群，造成衣原体经疫苗水平传播，从而有效防控畜禽衣原体的发生，降低养殖业的经济损失和公共卫生危害。

1 免疫阻断技术的示范应用

1.1 免疫

1.1.1 背景

本研究引进中国农业大学 “畜禽衣原体病综合防治技术与应用研究”（2008年教育部科学技术进步一等奖，证书号2008-144）技术成果，利用其提供的鸡衣原体亚单位基因工程疫苗、牛衣原体灭活疫苗、猪衣原体灭活疫苗，结合天津地区的实际情况，分别制定了适合禽场、牛场、猪场的免疫程序。

1.1.2 免疫程序

（1）禽免疫程序：30日龄、45日龄各免疫1次，剂量为0.5ml/只，每180天免疫1次，剂量为0.5ml/只。

（2）猪免疫程序：繁殖母猪在配种前或配种后1个月内免疫，种公猪春秋各免疫1次，免疫剂量为2ml/头份。

（3）牛免疫程序：适繁母牛在每次配种前1个月或配种后1个月免疫，免疫剂量为4～5ml/头，新生犊牛在断奶后1个月内注射疫苗，免疫剂量为2ml/头，种公牛每年免疫两次，免疫剂量为4～5ml/头。

1.1.3 材料和方法

（1） 样品

血清样品：鸡、猪、牛血清。

棉拭子样品：鸡咽喉棉拭子、母猪阴道棉拭子、牛阴道棉拭子。

（2） 试剂

衣原体间接血凝 (IHA)试验试剂，由中国农业科学院兰州兽医研究所提供，抗原批号130524，稀释液130524，阳性血清130403，阴性血清130524。

鹦鹉热衣原体 （ACP）核酸检测试剂盒：购自北京索奥生物医药科技有限公司。

（3） 疫苗

鸡衣原体亚单位基因工程疫苗、猪衣原体灭活疫苗、牛衣原体灭活疫苗。

（4） 方法

①间接血凝抑制试验 （IHA）

a)每孔加入75μl稀释液。

b)在第一孔加入25μl被检血清，呈4倍递增稀释3孔（1∶4～1∶16）， 第 3 孔弃去 25μl。 同一板上同时设阳性、 阴性和空白对照各2孔 （2个阳性、2个阴性）。

c)每孔加入稀释的抗原25μl，置微型振荡器上震荡2min，封口，在37℃作用2h后判定结果。

结果判定 ：对照试验成立前提下，出现 “++”以上的凝集现象者判为阳性凝集。

哺乳动物血清效价≥1∶64判为阳性。

禽类血清效价≥1∶16判为阳性。

②荧光PCR试验

a)衣原体基因组DNA提取。

样品处理：取1ml生理盐水加入离心管中，充分洗涤棉拭子，将洗涤液转至1.5ml干净离心管中，13000rpm离心5min，弃上清，保留沉淀。

向样品中加入50μl核酸提取液充分混匀，100℃裂解10min。13000rpm离心3min，取上清液4μl做PCR反应。

阴性质控品：取50μl阴性质控品加入50μl核酸提取液，充分震荡。然后 100℃裂解 10min，然后 13000rpm离心3min，取上清液4μl做PCR反应。

ACP-阳性质控品：直接取4μl进行PCR扩增。

b)PCR扩增

将ACP-PCR MIX、Taq酶系，室温融化并振荡混匀后，10000rpm离心10s。

设所需要的PCR反应管管数为N（N=样本数+1管阴性对照+4管阳性对照），每个测试反应体系配制为：ACP-PCR MIX 24μl， Taq 酶系 2μl。

c）结果判定

如果Ct值＜38，判定为阳性。

如果38＜Ct值＜40，为可疑，建议重新检测，重新检测若38＜Ct值＜40判为阳性，否则为阴性。

如果Ct值≥40，判定为阴性。

1.2 免疫抗体监测结果

在全市7个养殖场进行畜禽衣原体疫苗免疫技术的示范应用。分别在禽免疫前和免疫后30d，猪、牛免疫前和免疫后21d，采集血清样品和棉拭子样品，采用IHA间接血凝检测方法和荧光PCR检测方法进行抗体、抗原检测，结果见表1。

表1 示范场疫苗免疫前后监测结果

2 疫苗阻断技术的示范应用

2.1 种禽场常规弱毒疫苗的监测和筛选

2.1.1 鸡胚源弱毒疫苗样品

收集疫苗42份，其中鸡传染性法氏囊病弱毒疫苗6份，鸡传染性支气管炎弱毒疫苗2份，鸡痘活疫苗2份，鸡传染性喉气管炎弱毒疫苗2份；鸡新城疫传染性支气管炎二联弱毒疫苗15份；鸡新城疫弱毒疫苗15份。

2.1.2 试剂和检测方法 （见1.1.3中的 （2）和1.1.3中的 （4））

2.2 疫苗的监测和筛选

使用荧光PCR检测方法，对天津地区示范鸡场使用的常规弱毒疫苗进行监测和筛选，共检测样品42份，其中鸡新城疫活疫苗阳性检出率最高为26.7%、鸡传染性法氏囊病活疫苗阳性检出率为16.7%、鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗阳性检出率为20%，鸡痘活疫苗、鸡传染性喉气管炎弱毒疫苗、鸡传染性支气管炎弱毒疫苗样品中未检出衣原体抗原。检测结果见表2。对父母代种鸡免疫的鸡胚源疫苗的衣原体监测，阻止进口、国产弱毒疫苗携带病原感染种鸡群体，确保选用无污染的疫苗。

表2 不同生产厂家的不同批号鸡胚源疫苗衣原体抗原检测结果

3 示范应用效果

通过在畜禽示范场进行免疫阻断技术的示范应用，大幅降低了畜禽示范场的死淘率，详见表3。

表3 示范场示范应用前后死淘率比较

4 畜禽衣原体免疫阻断技术的推广应用

综上所述，已经完成的应用示范表明疫苗免疫效果确实，对畜禽无不良反应，减少了畜禽的死淘率，由此带动辐射天津市12个区县的畜禽养殖场进行疫苗免疫阻断的应用，共计禽只641000羽份，猪只107700头份，牛只62200头份。

表4 各区县推广情况 （单位：羽份、头份）

5 讨论和结论

动物衣原体病的传播流行给畜牧业生产造成严重的损失，直接影响着畜牧业的可持续发展，也对人类健康造成了严重的威胁，为有效控制衣原体病的发生和流行，可从水平方向进行阻断，应用疫苗免疫和疫苗筛选相结合的方法进行预防。

（1）7个示范场在疫苗免疫后抗体阳性率由免疫前19.68%上升至94.60%，免疫后抗原阳性率由免疫前的11.36%降至2.08%。

（2）7个示范场在疫苗免疫和疫苗筛选后死淘率由应用前的9.22%降至7.80%。

（3）疫苗注射后畜禽的饮水、进食和精神状态均无异常，生产性能基本正常，说明示范的衣原体疫苗有效性、安全性良好。

（4）通过对鸡场的鸡胚源疫苗进行筛选和监测，说明一些疫苗中确实存在衣原体感染，通过疫苗监测和筛选确实能够阻止衣原体在疫苗上的传播，但由于各鸡场用的疫苗种类不同、生产厂家也不尽相同，故此方法不适用于大规模推广。