曾 荣 刘宇甄 童建波 何艳艳 林 彤 徐浩翔 李 岷

遗传性对称性色素异常症一家系ADAR1基因新突变

曾 荣1,2刘宇甄1,2童建波1,2何艳艳1,2林 彤1,2徐浩翔1,2李 岷1,2

目的： 确定一遗传性对称性色素异常症家系ADAR1基因的突变位点。方法： 提取家系中2例患者、2名表型正常者及50名与本家系无关的正常对照外周血DNA，采用PCR技术扩增ADAR1基因所有编码区并进行测序。结果： 该家系中2例患者均存在ADAR1基因错义突变(c.662C>T)，导致p.P211R改变，家系中2名未患病的个体和50名健康对照均未发现上述突变。结论： ADAR1基因c.662C>T错义突变是导致该家系发生DSH的致病性突变，在国内外属首次报道。

遗传性对称性色素异常症； ADAR1； 基因突变

遗传性对称性色素异常症(dyschromatosis symmerica hereditaria, DSH)，亦称为土肥肢端色素沉着症，是一种少见的常染色体显性遗传皮肤病[1]。典型的临床表现为肢端伸侧尤其是手背/足背部出现对称性色素减退斑和色素沉着斑，面部的皮损类似于雀斑，可不伴色素减退斑[2]。2003年，日本学者Miyamura等采用全基因组扫描和候选基因测序，确定本病的致病基因为双链RNA特异性腺苷脱氨酶(adenosine deaminase acting on RNA1，ADAR1)基因[3]。目前国内外均有散发或家族性DSH的报道。我们对一个DSH家系进行了临床资料的收集和分子遗传性检测。

1 资料和方法

1.1 临床资料 先证者,男，20岁，汉族。因四肢末端色素沉着、色素减退斑10年就诊于我院。10岁开始双手背和足背出现散在针尖至粟粒大色素沉着斑和色素减退斑，随着年龄增长皮疹逐渐增多扩大，并蔓延至双前臂、双踝关节，皮损表现为深浅不一的圆形、不规则形色素沉着、色素减退斑，境界清楚，部分融合成网状，无瘢痕(图1)，无自觉症状。日晒后手背、前臂皮损可加重。父母否认近亲结婚(图2)。

图1 双手背、足背不规则色素沉着斑和色素减退斑

图2 遗传性对称性色素异常症患者家系图

1.2 实验方法

1.2.1 基因组DNA提取 经过知情同意后，分别采集家系成员静脉血各3 mL，其中2例患者和非患者1人；同时提取50名与本家系无关的正常人DNA作为对照。采用美国promega公司DNA提取试剂盒提取基因组DNA.

1.2.2 引物设计 根据ADAR1基因的mRNA序列设计15对PCR引物扩增ADAR1基因所有外显子编码区和侧翼序列。其中第14/15外显子引物为：上游引物：5'-AGGTTTCCATCTTTCTCCCG-3'，下游引物：5'-ACACCCTAGTATGACACACC-3'，所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.3 PCR扩增 扩增条件：94℃预变性5 min后，94℃变性45 s，56℃～62℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35个循环。72℃后延伸10 min，扩增结束后用15g/L琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物。PCR产物经过纯化后直接在ABI 377型全自动测序仪(美国Applied Biosystem公司)上测序，所有测序结果与NCBI blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)等数据库进行分析比对。

2 结果

以家系中2例患者和2名非患者的基因组DNA为模板，15对引物在各自条件下分别扩增出各自的产物，产物纯化后测序，将患者全部外显子直接测序结果与上述数据库中所公布的序列进行比对。结果发现，该家系中2例患者ADAR1基因的第662位碱基胞嘧啶(C)突变为(G)，引起ADAR1基因的第2外显子221位密码子由CAA变成CGA(图3)，导致正常的脯氨酸被精氨酸替代。家系中非患者及50名无亲缘关系的正常人对照未见该改变。

图3 ADAR1基因测序图 a：先证者，b：正常对照。ADAR1基因发生c.662C>T错义突变，导致第221位氨基酸由脯氨酸变为精氨酸

3 讨论

DSH是一种少见的常染色体显性遗传性皮肤病。可见于各个种族，但是以亚洲人居多，其中中国和日本病例报道较多[4]。该病由日本学者Toyama在1929年报道。约73%患者在6岁前发病，该病极少累及其他系统。主要临床表现为手、足部对称性色素沉着、色素减退斑，面部皮损类似于雀斑样损害，可不伴有色素减退。患者一般无自觉症状，色素沉着日晒后加重，夏重冬轻，可持续终生。组织病理表现为色素沉着区黑色素细胞减少，但分泌黑素的活性增强，大量的黑素沉积于基底层。在色素减少区几乎无色素沉积，黑素细胞数量也减少，并且这些细胞中有很多的退化细胞质空泡形成[4,5]。随着Miyamura等确定ADAR1基因为本病的致病基因，对于不同的散发或家系DSH患者致病基因的突变检测成为了一个研究热点。

人类的ADAR1基因全长30 kb，相对分子量为39000Da，包含15个外显子，编码1226个氨基酸序列的双链RNA特异性腺苷脱氨酶[3]。该酶至少包括6个功能域，依次为2个Z-alpha 区(覆盖2号外显子前半部分编码)，引导该蛋白靠近正在转录的DNA，以便对底物RNA发生作用；3个dsRNA结合区(DRBM)(覆盖2～7号外显子)，主要进行底物识别并结合底物的作用；1个酶催化结构域(ADEAMc区)(包含9～15号外显子)，实现腺苷的脱氨基作用[6]。迄今为止，国内外文献共报道该基因突变约150余种，其中主要是错义突变，不少于60%的出现在第9～15号外显子[7，8]。

我们通过研究该家系发现ADAR1基因的第2外显子221位密码子由CCA变成CGA(c.622C>T)，导致脯氨酸被精氨酸取代(p.P211R)。而家系中正常人及50名无关正常对照者未发现此改变。发生此突变后，由于氨基酸化学结构的不同，则可能会引起所编码蛋白质功能域的改变，进而成为导致DSH发病的分子机制之一。查阅国内外文献未发现有该突变的报道，证实为新的突变。

总之，我们通过对1个DSH家系的研究，发现了ADAR1基因的一个错义突变(c.622C>T)，导致p.P211R改变。经查阅国内外文献为首次报道的新突变。我们的结果丰富了ADAR1基因的突变谱，可为深入研究DSH发病分子遗传学机制提供一定的理论依据，同时也可为该家系进行产前诊断和遗传咨询提供实验依据。

[1] Ostlere LS, Ratnavel RC, Lawlor F, et al. Reticulate acropigmentation of Dohi[J]. Clin Exp Dermatol,1995,20(6):477-479.

[2] 赵辨.中国临床皮肤病学[M].南京：江苏科学技术出版社,2009.1249-1250.

[3] Miyamura Y, Suzuki T, Kono M, et al. Mutations of the RNA-specific adenosine deaminase gene (DSRAD) are involved in dyschromatosis symmetrica hereditaria[J]. Am J Hum Genet,2003,73(3):693-699.

[4] Oyama M, Shimizu H, Ohata Y, et al. Dyschromatosis symmetrica hereditaria (reticulate acropigmentation of Dohi): report of a Japanese family with the condition and a literature review of 185 cases[J]. Br J Dermatol,1999,140(3):491-496.

[5] Yang Y, Li S, Li H, et al. DSRAD gene mutations in three families with dyschromatosis symmetrica hereditaria[J]. Beijing Da Xue Xue Bao，2004,36(5):466-468.

[6] Wang Y, Zeng Y, Murray JM, et al. Genomic organization and chromosomal location of the human dsRNA adenosine deaminase gene: the enzyme for glutamate-activated ion channel RNA editing[J]. J Mol Biol，1995,254(2):184-195.

[7] Li CR, Xu XL, Sun XJ, et al. Two new mutations of the ADAR1 gene associated with dyschromatosis symmetrica hereditaria[J]. Arch Dermatol Res，2010,302(6):477-480.

[8] Li M, Yang L, Li C, et al. Mutational spectrum of the ADAR1 gene in dyschromatosis symmetrica hereditaria[J]. Arch Dermatol Res，2010,302(6):469-476.

(收稿：2017-04-28)

IdentificationofanovelmutationofADAR1geneinafamilywithdyschromatosissymmetricalhereditaria

ZENGRong1,2,LIUYuzhen1,2,TONGJianbo1，2,HEYanyan1,2,LINTong1,2,XUHaoxiang1,2,LIMin1,2.

1.InstituteofDermatology,ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege,Nanjing210042,China; 2.JiangsuKeyLaboratoryofMolecularBiologyforSkinDiseases&STDs,Nanjing210042,China

s:XUHaoxiang,E-mail:xbpipi@163.comLIMin,E-mail:drlimin@sina.cn

Objective: To identify the mutation of ADAR1 gene in a family with dyschromatosis symmetrical hereditaria (DSH).Methods: Genomic DNA was extracted from the peripheral blood of the family members (including 2 patients and 2 unaffected members) and 50 healthy controls. All the exons of ADAR1 gene and their flanking intronic sequences were amplified by PCR and direct sequencing was performed to screen the mutations in gene.Results: A missense mutation (c.662C>T) in ADAR1 gene was identified in the two patients and none mutation was found in 2 normal family members and healthy controls.Conclusion: The missense mutation (c.662C>T) in the ADAR1 gene probably underlies the DSH in this family, which is the first report in the date base.

dyschromatosis symmetrica hereditaria; ADAR1; gene mutation

中国医学科学院医学与健康科技创新工程项目(编号：2016-I2M-1-003) 江苏省自然科学基金(编号：BK20150068) 国家自然科学基金(编号：81673087) 国家自然科学基金青年项目(编号：81502739) 北京协和医学院青年基金项目(编号：3332016108)

1中国医学科学院&北京协和医学院皮肤病研究所,2100422江苏省皮肤性病学分子生物学重点实验室,210042

徐浩翔, E-mail: xbpipi@163.com 李 岷, E-mail: drlimin@sina.cn