甄 珍

(齐齐哈尔出入境检验检疫局，黑龙江 齐齐哈尔 161005)

番茄酱中霉菌的霍华德计数方法分析

甄 珍

(齐齐哈尔出入境检验检疫局，黑龙江 齐齐哈尔 161005)

目的：拟对番茄酱中霉菌的霍华德计数方法进行详细分析。方法：依据标准要求，番茄酱中霉菌检验需使用霍华德计数方法，而GB 4789.15-2016 标准中只是简单地规定检验步骤，并未对检验过程中的难点即镜检时如何分辨霉菌菌丝进行详细描述。实验通过GB 4789.15-2016、SN/T 3934-2014、AOAC 984.29 这3种检验方法的比较分析，以及实验过程中的镜检照片，对番茄酱中霉菌的霍华德计数法的镜检方法进行详细分析。结果：AOAC 984.29 方法中对霉菌特征进行了详细描述，可作为参考，依据实验具体的镜检照片便可解决用霍华德计数法对番茄酱中霉菌检验时的难题。结论：用霍华德计数法对番茄酱中霉菌检验时需严格区分霉菌菌丝与番茄组织细胞，用实验介绍的方法可帮助区分霉菌菌丝与番茄组织细胞，避免出现假阳性结果。

番茄酱；霉菌；霍华德计数；镜检；番茄组织细胞

霉菌作为评价食品卫生质量的指标菌之一，能够反映食品有无受到霉菌的污染，加工制品的原料有无霉菌所致的腐烂存在[1-3]。标准要求番茄酱中霉菌检验使用霍华德计数法，以验证番茄酱所使用的番茄原料的卫生质量情况，尤其是霉菌在番茄上生长繁殖的情况[4]。GB 4789.15-2016《食品微生物学检验 霉菌和酵母菌计数》标准的第二法：霉菌直接镜检计数法[5]，该方法中规定了检验操作步骤，但未对检验过程中的难点即镜检时如何区分霉菌菌丝与番茄组织细胞进行详细描述，SN/T 3934-2014《出口食品中霍华德计数方法》标准也未对此难点进行详细描述。本实验通过GB 4789.15-2016《食品微生物学检验 霉菌和酵母菌计数》、SN/T 3934-2014《出口食品中霍华德计数方法》[6,7]、AOAC 984.29《番茄制品中霉菌和腐烂污物的测定方法》这3种检验方法的比较分析[8]，以及实验过程中的镜检照片，对番茄酱中霉菌的霍华德计数法的镜检方法进行了详细分析。

1 材料和方法

1.1 试验仪器与器材

显微镜：Leica DM750、生物安全柜：ESCO AB2-4S1、阿贝折光仪：ATAGO 3T、烧杯、霍华德计数玻片。

1.2 试验材料

番茄酱：购自齐齐哈尔林田生态农业有限公司。

1.3 方法

1.3.1 方法依据

GB 4789.15-2016《食品微生物学检验 霉菌和酵母菌计数》。

1.3.2 样品制备

取适量样品，加蒸馏水稀释至折光指数为1.3447～1.3460(即浓度为7.9%～8.8%)，备用。将显微镜按放大率90～125倍调节标准视野，使其直径为1.382 mm。将霍华德计数玻片清洗干净，将制备好的样品液，用玻璃棒均匀地摊布于计测室，加盖玻片，以备观察。

1.3.3 观测

将制好的载玻片置于显微镜标准视野下进行观测。同一样品应由2人进行观察，每人观察50 个视野。本实验依据AOAC 984.29《番茄制品中霉菌和腐烂污物的测定方法》中描述的霉菌特征，对霉菌菌丝与番茄组织细胞进行辨别区分。

1.3.4 结果计算与报告

在标准视野下，发现有霉菌菌丝长度超过标准视野(1.382 mm)的1/6 或3根菌丝总长度超过标准视野的1/6(即测微器的1格)时即记录为阳性(+)，否则记录为阴性(-)。结果报告每100 个视野中全部阳性视野数为霉菌的视野百分数(视野，%)。

2 结果

2.1 样品制备

取适量样品，加蒸馏水稀释至折光指数为1.3452。将显微镜按放大率90～125倍调节标准视野，使其直径为1.382 mm。将霍华德计数玻片清洗干净，将制备好的样品液，用玻璃棒均匀地摊布于计测室，加盖玻片，以备观察。

2.2 观测

AOAC 984.29《番茄制品中霉菌和腐烂污物的测定方法》中概括说明了霉菌的诊断特征，这些特征是在100～400 倍显微镜下观察到的。

平行壁：霉菌菌丝呈管状。对数情况下，整个菌丝体的直径是一致的，因此在显微镜下菌丝壁看起来像两条平行的线，这是在辨认霉菌和其他纤维区别时最重要的特征之一。不过也有例外，某些较大的霉菌，菌丝壁可能塌陷或扭曲，而某些霉菌菌丝可能沿壁膨大，因而就不平行了。毛霉菌和白地霉菌的菌丝经常是减缩的。

隔膜：许多霉菌菌丝被横膈膜分成节段。其中植物细胞壁看起来是呈节段的，但它们的细胞壁常常是收敛的，且形成尖锐的点。毛霉菌和其他少数霉菌一般无横膈膜。

成粒作用：薄壁、呈管状的菌丝含有原生质，在高倍放大镜下透过细胞壁可见其成粒状或点状的原生质，这在某些毛霉菌中看得很清楚。某些细小的霉菌，例如一种引起炭疽病的霉菌原生质的成粒作用并不明显。有些霉菌，如偶尔在奶油中发现的霉菌，其原生质已消失，只留下薄壁、透明的、几乎不可见的管体，这种空的霉菌是很难计数的。有时，菌丝变得像棉花纤维一样扭曲。原生质常常断续地分开，由几乎不可见的菌丝壁连接形成短链或链状。

分岔：如果霉菌菌丝不太短，则多数呈现大量分岔。分岔和主干的直径几乎相同。有分岔存在是鉴定霉菌最可靠的特征之一。

菌丝端部：菌丝的尖端常呈钝圆形，有些像指尖。除增殖期的(再生的)菌丝外，很少出现尖状的。有时菌体膨大成球或头状，尤其是菌丝形成增殖体的时候。折断的菌丝端部一般是方形的。紧邻断头部分的菌丝有可能塌陷，且可能不含原生质。

无折射现象：菌丝不强烈地折光。在霉菌制备中看到有些物体像菌丝，但它们具有很强的折射现象，如植物导管壁增厚展开的螺旋体，这些物体像突心玻璃或塑料棒一样折光。

AOAC 984.29《番茄制品中霉菌和腐烂污物的测定方法》中描述的霉菌特征见图1。

图1 AOAC 984.29《番茄制品中霉菌和腐烂污物的测定方法》中描述的霉菌特征Fig.1 The mould characteristics described in AOAC 984.29 Method for Determination of Mould andRot in Tomato Products

AOAC 984.29《番茄制品中霉菌和腐烂污物的测定方法》中描述的在镜检状态下番茄组织形态和霉菌菌丝形态见图2。

图2 AOAC 984.29《番茄制品中霉菌和腐烂污物的测定方法》中描述的在镜检状态下番茄组织形态和霉菌菌丝形态Fig.2 The morphology of tomato and mould hyphae described in AOAC 984.29 Method for Determination of Mouldand Rot in Tomato Products

镜检状态下霉菌菌丝和番茄组织形态见图3。

图3 镜检状态下霉菌菌丝和番茄组织形态Fig.3 The morphology of mould hyphae and tomato under microscope

注：A，B为番茄组织细胞，C～I为霉菌菌丝。

2.3 结果计算与报告

同一样品由2人进行观察，每人观察50个视野。结果报告每100个视野中全部阳性视野数为霉菌的视野百分数(视野，%)，最后结果为8%。

3 讨论

在进行霉菌计数前，分析者应熟悉制品的细胞结构。可通过直接在显微镜下观察从生产品取下的健康组织或通过阅读有关参考书来获取这方面的知识[9-15]。任何制品都可能被各种植物、动物和合成纤维污染，这些物质的存在大大增加了被误认为是霉菌的可能性。分析者应能识别菌丝和看似相像且易混淆的物质。虽然多数丝状体能够比较容易和准确地确认为霉菌，但有些则需要仔细辨别后才能确定，几乎不可能同时观察到霉菌的所有特征，通常缺少2～3项。用霍华德计数法对番茄酱中霉菌检验时需严格区分霉菌菌丝与番茄组织细胞，用本实验介绍的方法可帮助区分霉菌菌丝与番茄组织细胞，避免出现假阳性结果。

[1]廉慧锋，张敏爱，张建军，等.调味粉中霉菌的霍华德计数方法研究[J].中国调味品，2014，39(1):14-17.

[2]武运，杨艳玲，逢焕明，等.新疆番茄酱品控分析初探[J].中国调味品，2009，34(11):98-101.

[3]朱曜.番茄酱罐头霉菌污染源的调查及防止的试验研究[J].食品工业，1991(5):10-11.

[4]朱曜.番茄制品霉菌计测及用TcA-Tob合剂处理霉菌[J].食品科学，1992,152(8): 54-57.

[5]GB 4789.15-2016，食品微生物学检验 霉菌和酵母计数[S].

[6]SN/T 3934-2014，出口食品中霍华德计数方法[S].

[7]马昌文.新疆制定番茄酱检测行业标准[J].中国酿造,2009(12):90.

[8]AOAC 984.29，番茄制品中霉菌和腐烂污物的测定方法[S].

[9]关正君，郭斌，尉亚辉.樱桃番茄叶体细胞胚发生的组织细胞学观察[J].电子显微学报，2011,30(2):158-165.

[10]戴伟民，赵艳，蔡润，等.番茄耐盐愈伤组织的筛选及显微结构观察[J].上海交通大学学报(农业科学版)，2001,19(2):112-116.

[11]郭富长，孟广云，但汉斌.番茄、青椒和茄子胚珠发育的显微形态学观察[J].华北农业学报，1996,11(3):96-100.

[12]陈火英，张建华，于俊棠，等.番茄离体培养过程中器官发生的细胞组织学观察[J].武汉植物学研究，2001,19(2):91-95.

[13]陈火英，张建华，钟建江，等.番茄下胚轴离体培养植株再生及其组织学观察[J].西北植物学研究，2000,25(5):759-765.

[14]刘克斌，李曙轩.番茄叶组织培养中愈伤组织形成和器官发生的细胞学和微形态学研究[J].广西植物，1991(3):240-246.

[15]谭晓连.番茄幼叶离体培养的细胞组织学研究[J].植物学报，1986(z1):80-85.

Analysis of Howard Counting Method for Mould in Ketchup

ZHEN Zhen

(Qiqihar Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Qiqihar 161005, China)

Objective: To make a detailed analysis of Howard counting method for mould in ketchup. Method: According to the standard requirements, the detection of mould in ketchup should use Howard counting method, and GB 4789.15-2016 standard just specifies the inspection steps simply,not describes the difficulties in the inspection process in detail, that is how to distinguish fungal hyphae.Through the comparative analysis of these three kinds of inspection methods such as GB 4789.15-2016, SN/T 3934-2014, AOAC 984.29,and the microscopic photos in experimental process, the inspection procedures of Howard counting method for mould in ketchup are analyzed in detail.Results:In AOAC 984.29 method, the characteristics of mould are described in detail, it can be used as a reference, and based on these experimental microscopic photos, the problems of Howard counting method for detecting mould in ketchup can be solved. Conclusion: The detection of mould in ketchup with Howard counting method should strictly distinguish the fungal hyphae and tomato tissue cells, the methods used in this experiment can help distinguish the fungal hyphae and tomato tissue cells, to avoid the false positive results.

ketchup；mould；Howard counting method；microscopic inspection；tomato tissue cells

2017-03-28

甄珍(1983-)，女，工程师，硕士，研究方向：食品、农产品微生物及转基因检验。

TS201.3

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.09.033

1000-9973(2017)09-0134-04