唐国瑾，孙晓东，王辉，武亚楠，刘睿

(大连民族大学 环境与资源学院，辽宁 大连 116600)

米曲霉YP4-1发酵豆酱过程中的氨基酸态氮含量测定

唐国瑾，孙晓东*，王辉，武亚楠，刘睿

(大连民族大学 环境与资源学院，辽宁 大连 116600)

家庭自制豆酱是东北三省非常普遍的佐菜食品，其制作的方法是利用空气中的微生物自然发酵而成。氨基酸态氮指的是以氨基酸形式存在的氮元素的含量，是判定发酵食品如酱油、料酒、大酱发酵品质的重要指标。该研究从131份东北三省家庭自制豆酱中分离发酵功能菌株，利用脱脂牛奶平板初筛，麦麸固体培养基复筛，采用福林酚法测定蛋白酶活性大小，其中米曲霉YP4-1具有很强的蛋白酶活性。将YP4-1单菌接种于豆酱中发酵培养90天，采用甲醛值法每隔10天测定豆酱样品中氨基酸态氮含量，结果显示：发酵第50天时氨基酸态氮含量最高，为0.46 g/mL。

豆酱；蛋白酶活性；米曲霉；氨基酸态氮

传统家庭自制豆酱是一种普遍的发酵食品，距今已有3000多年的历史，是人们日常生活中不可或缺的佐菜食品，其味道鲜美、营养丰富、口味独特、易于消化和吸收[1]。由于家庭自制豆酱开放的制作环境，导致豆酱表面附着大量真菌，真菌通过代谢可以产生蛋白酶等次生代谢产物[2]。蛋白酶是催化蛋白质水解的一种很重要的酶，被广泛运用于生产生活的各个方面[3]。蛋白酶可分为外肤酶和内肤酶两大类，外肤酶只对底物的C 端或N 端的肤键有作用，内肤酶只能水解大分子蛋白内部的肤键，是真正的蛋白酶[4]。目前，蛋白酶常被应用于面包生产、肉类嫩化和皮革工业的脱毛和软化等方面[5]。本研究从我国东三省采集到131份豆酱样品，获得纯培养真菌菌株301份，对这些菌株进行蛋白酶活性的筛选，获得高产蛋白酶的菌株YP4-1。利用甲醛值法[6]对该菌株发酵的豆酱进行氨基酸态氮含量的测定[7]。本研究为筛选优良的发酵功能菌株、提高发酵豆酱的品质奠定了理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

自然发酵豆酱：取自东三省地区的农户家里；氢氧化钠(分析纯)、福林酚试剂：上海索莱宝生物科技有限公司；酪氨酸：上海酶联生物科技有限公司；其余试剂均为分析纯：天津科密欧化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

奥林帕斯CX21显微镜 日本奥林帕斯公司；HZQ-Q全温振荡培养箱 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；XFH-75C电热式压力蒸汽灭菌锅 深圳市鼎鑫宜实验设备有限公司；SW-CJ-ID型单人净化工作台 苏州净化设备有限公司；磁力搅拌器 上海鹰迪仪器设备有限公司；酸度计 上海洪纪仪器设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 产蛋白酶菌株的筛选

通过对131份采自东北三省各地的家庭自制豆酱进行分离，对获得的纯培养真菌菌株经脱脂牛奶平板初筛，如表现出蛋白酶活性，则会在培养基的背面形成透明的水解圈。

1.3.2 发酵复筛

采用具有天然成分的麦麸固体培养基，以麦麸∶豆饼粉∶水为4∶1∶3的比例配制，灭菌后将初筛具有活性的菌株接入，25 ℃黑暗培养5天。在发酵培养基中加入50 mL无菌的去离子水，分散均匀，30 ℃震荡培养4 h，静置。滤液在4200 r/min下离心20 min，取上清液作为粗酶液测定。

1.3.3 酶活测定

采用福林酚法测定蛋白酶的活性[8]。

1.3.4 豆酱的制作及单菌发酵

挑选饱满的大豆浸泡，变软后煮透，捣碎。分装到罐头瓶中，每瓶装120 g。用封口膜封严，121 ℃灭菌60 min。将菌株YP4-1接种到PDA培养基上活化，挑取新鲜菌落用无菌水制成浓度为1×106cfu/mL的菌悬液。超净台内将菌悬液取1 mL单菌接种于灭菌的大豆中，25 ℃培养。待菌落长满大豆表面时加入12%(W/W)的盐水，常温发酵90天。

1.3.5 氨基酸态氮含量测定

在发酵期间，每隔10天测定豆酱发酵过程中的氨基酸态氮含量，采用甲醛值法(GB/T 5009.39-2003)[9]。

2 结果与分析

2.1 产蛋白酶菌株的筛选

通过脱脂牛奶平板初筛，菌株YP4-1在培养基背面形成透明圈，证明此菌具有蛋白酶活性。发酵复筛后的粗酶液经福林酚法测定的蛋白酶活性大小见表1。

表1 YP4-1的透明圈大小及蛋白酶活力Table 1 The size of transparent zone and protease activity of YP4-1

2.2 氨基酸态氮含量测定结果

对发酵豆酱每隔10天测其氨基酸态氮含量，其含量随发酵时间的变化规律见图1。

图1 YP4-1发酵豆酱的氨基酸态氮含量Fig.1 The content of amino acid nitrogen of soybean paste fermented by YP4-1

由图1可知，发酵初始氨基酸态氮的含量随着发酵时间的延长逐步增加，在发酵50天时达到了最大值，之后氨基酸态氮的含量呈现小范围的波动，至后期菌丝老化，菌体代谢减弱至停止，氨基酸态氮的含量逐渐下降。

3 讨论

发酵是酱油、大酱生产的主要环节，也是蛋白质分解的过程以及分解物再次发生复杂反应的过程[10]。这个过程产生的氨基酸态氮亦称氨基氮，是由大豆和或脱脂大豆、小麦和或麸皮中的蛋白质水解产生的，是衡量发酵能力的重要指标。在YP4-1接种的发酵体系中，发酵初始氨基酸态氮的含量呈直线上升趋势，这个阶段生成的氨基酸及相应的代谢产物参与了糖类和脂类的合成反应，有一些氨基酸参与了丙酮酸、乙酰CoA、α-酮戊二酸、琥珀酰CoA、延胡索酸、草酰乙酸等物质的合成，使氨基酸为其他物质的代谢循环提供了碳骨架[11]。在发酵后期，菌体处于老化状态，菌体代谢产生的蛋白酶系逐渐降低至停止，体系中氨基酸态氮的含量逐渐降低。由于YP4-1来源于空气中，为野生型发酵功能菌株，其产蛋白酶的活力及发酵性能均有可优化与提升的空间。米曲霉是公认的食品安全菌株，具有很强的蛋白酶合成能力，其蛋白酶在较广的pH范围内均具有活性，另外由于米曲霉含有丰富的糖苷水解酶，可以利用淀粉或纤维素等廉价原料高效生产蛋白酶，所以米曲霉是食品用蛋白酶的主要来源菌株。本研究为筛选优良的发酵功能菌株、提高发酵豆酱的品质奠定了理论基础。

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Detection of Amino Acid Nitrogen Content of Soybean Paste Fermented byAspergillusoryzaeYP4-1

TANG Guo-jin, SUN Xiao-dong*, WANG Hui, WU Ya-nan, LIU Rui

(College of Environment and Resources, Dalian Nationalities University, Dalian 116600, China)

Homemade soybean paste is a very common food in three provinces of the northeast of China. It is fermented by microorganism in the air. Amino acid nitrogen refers to the nitrogen content that exists in the form of amino acid, and it is the important indicator to distinguish the fermentation quality of the fermented foods such as soy sauce, cooking wine and soybean paste. Isolate the strains with fermentation functions from 131 homemade soybean paste samples in the northeast three provinces. Use skim milk plate and wheat bran solid medium to select, and the Folin-phenol Reagent Method is used to detect the protease activity. The strain ofAspergillusoryzaeYP4-1 is found with high protease activity. Use YP4-1 to ferment soybean paste for 90 days,and the content of amino acid nitrogen is detected every 10 days. The result shows that amino acid nitrogen content is the highest in the 50th day,reaching to 0.46 g/mL.

soybean paste；protease activity；Aspergillusoryzae；amino acid nitrogen

2017-03-16 *通讯作者

国家自然基金青年基金项目(31200014)；中央高校自主基金项目(DC201501012)；大连民族大学大学生创新训练项目(XA201612346)

孙晓东(1979-)，女，山东掖县人，高级工程师，博士，研究方向：真菌分类与真菌毒素的检测。

TS201.5

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.09.027

1000-9973(2017)09-0113-03