张忠平,杨旭

(1.哈尔滨市食品质量安全检测中心，哈尔滨 150036；2.哈尔滨市食品工业研究所，哈尔滨 150025；3.哈尔滨市食品工业研究所有限公司，哈尔滨 150025)

黑曲霉WS003固态发酵制备果胶酶条件的优化

张忠平1,杨旭2,3*

(1.哈尔滨市食品质量安全检测中心，哈尔滨 150036；2.哈尔滨市食品工业研究所，哈尔滨 150025；3.哈尔滨市食品工业研究所有限公司，哈尔滨 150025)

以豆粕和麸皮为主要培养基、黑曲霉WS003为发酵菌株，利用固态发酵法生产果胶酶。通过单因素试验确定了碳氮比为40∶1、菠萝皮为诱导物、磷酸氢二钾为无机营养盐；采用正交试验对培养条件进行了优化。结果表明：菠萝皮的添加量为0.15 g/10 g干基、发酵pH为6.0、磷酸氢二钾浓度为0.2%时，果胶酶产酶活力最高，达到81.06 U/mL。

黑曲霉；固态发酵；果胶酶

黑曲霉是食品工业中重要的发酵菌种，可产生果胶酶、糖化酶、淀粉酶等多种酶，主要用于柠檬酸发酵、食醋和白酒制曲等方面。果胶质广泛存在于植物中，有“粘合细胞组织”的作用，是植物细胞壁和胞间层的重要组分[1]。果胶酶是指分解果胶质复合酶的总称[2]，应用于酿造果酒果醋、饲料、木材防腐、植物病防治和环境保护等方面。尤其是在食品行业中，果胶酶可以降低果汁、果酒以及果醋的粘度，提高出汁率，起着增加澄清度的作用。黑曲霉是国际上公认的安全发酵微生物[3]，用其生产果胶酶，发酵周期短、安全可靠、优势明显。固态发酵法应用广泛、历史悠久，尤其是在酶制剂的生产中得到了普遍应用[4]。本试验通过对黑曲霉高产果胶酶诱变菌株WS003固体发酵，采用单因素试验和正交试验确定其最佳产酶条件，旨在为果胶酶的生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌种

黑曲霉(Aspergillusniger)WS003：本实验室提供；麸皮、豆粕：市售。

1.2 斜面培养基(PDA)

马铃薯200 g去皮，切块煮沸30 min，纱布过滤，葡萄糖20 g及琼脂20 g，补水至1000 mL，pH自然。

1.3 基础培养基

麸皮10 g，豆粕0.25 g，装入250 mL三角瓶中，料水比1∶1.5 (W/V)。

1.4固体发酵[5]

无菌水洗下斜面上的孢子，用装有玻璃珠的三角瓶震荡制成孢子悬液。将一定量的孢子悬液接种至固体发酵培养基中，36 ℃培养72 h。

1.5 果胶酶活力的测定方法

采用DNS法(3，5-二硝基水杨酸法)[6]，底物为pH 4.0的0.4%果胶溶液。取0.5 mL适当稀释的发酵上清液，加入2 mL底物溶液，于45 ℃水浴30 min，加入DNS试剂混匀，煮沸5 min，立即冷却定容至25 mL，540 nm处测吸光值。活力定义：上述条件下每1 min分解果胶产生1 μmol半乳糖醛酸所需的酶量定义为1个活力单位(U)。

2 结果与分析

2.1 不同诱导物对黑曲霉产果胶酶活力的影响

2.1.1 菠萝皮对果胶酶活力的影响

分别将0.1,0.2,0.3,0.4 g的菠萝皮粉作为诱导物添加到培养基中，接种一定量的黑曲霉悬液，置于36 ℃恒温培养箱中，定期摇动，72 h后浸提，测定果胶酶活力，试验结果见图1。

在发酵过程中，菠萝皮既可以作为碳源又可以作为诱导物。由图1可知，其用量对产酶影响较大，在培养基中添加0.2 g菠萝皮产果胶酶能力最强，达到66.12 U/mL，但随着添加量的增加，菠萝皮中的抑制产果胶酶成分会逐渐增加，造成果胶酶活力的下降。

2.1.2 西瓜皮对果胶酶活力的影响

分别将0.25，0.5，1，1.5，2.5，3 g的西瓜皮粉作为诱导物添加到培养基中，接种一定量的黑曲霉悬液，置于36 ℃恒温培养箱中，定期摇动，72 h后浸提，测定果胶酶活力，试验结果见图2。

由图2可知，在培养基中添加2.5 g的西瓜皮产果胶酶能力最大，达到了60.84 U/mL，但明显不如以菠萝皮为诱导物的果胶酶活力高，故选择菠萝皮作为适宜的诱导物，添加量为0.2 g/10 g干基。

2.2 不同发酵pH值对黑曲霉产果胶酶活力的影响

调整培养基用水的pH值分别为3.5，4.0，4.5，5.0，6.0，接种一定量的黑曲霉悬液，置于36 ℃恒温培养箱中，定期摇动，72 h后浸提、测定果胶酶活力，试验结果见图3。

图3 发酵pH对果胶酶活力的影响

由图3可知，pH在5.0～6.0果胶酶活力较高，在64 U/mL左右，故选择5.0～6.0为最适发酵pH值。

2.3 不同无机盐对黑曲霉产果胶酶活力的影响

2.3.1 磷酸氢二钾对果胶酶活力的影响

磷酸盐非常适合微生物的生产，既可以起到一定的缓冲作用，又可以防止微生物代谢造成的培养基过酸或者过碱。在培养基中按照0.1%，0.2%，0.3%加入磷酸氢二钾，接种一定量的黑曲霉悬液，置于36 ℃恒温培养箱中，定期摇动，72 h后浸提，测定果胶酶活力，试验结果见图4。

图4 磷酸氢二钾对果胶酶活力的影响

由图4可知，磷酸盐在0.2%的浓度时，果胶酶活力最大，为65.87 U/mL，但更高浓度的磷酸盐反而会对产酶有抑制作用，故选择0.2%为最适的磷酸氢二钾浓度。

2.3.2 硫酸镁对果胶酶活力的影响

在培养基中按照0.1%，0.2%，0.3%加入MgSO4溶液，接种一定量的黑曲霉悬液，置于36 ℃恒温培养箱中，定期摇动，72 h后浸提，测定果胶酶活力，试验结果见图5。

图5 硫酸镁对果胶酶活力的影响

由图5可知，硫酸镁的浓度为0.2%时，果胶酶活力最大，为61.79 U/mL。比较磷酸氢二钾和硫酸镁对果胶酶活力的影响，磷酸氢二钾要大一些，故选择磷酸氢二钾作为最适的无机盐。

2.4 不同碳氮比对黑曲霉产果胶酶活力的影响

菌体生长需要合适的碳源和氮源，不同的碳氮比例对果胶酶的发酵生产影响很大。选择麸皮和豆粕为碳源和氮源，按比例20∶1，30∶1，40∶1，50∶1进行培养基配比，接种一定量的黑曲霉悬液，置于36 ℃恒温培养箱中，定期摇动，72 h后浸提，测定果胶酶活力，试验结果见图6。

图6 碳氮比对果胶酶活力的影响

由图6可知，碳氮比为40∶1时，果胶酶活力最高，故选择最适的碳氮比例为40∶1。

2.5 正交试验对果胶酶活力的影响

选择菠萝皮添加量、磷酸氢二钾浓度和发酵pH 3个因素为影响黑曲霉产酶条件的主要因素进行试验，因素水平表见表1，正交试验结果见表2。

表1 因素水平表

表2 正交试验结果

由表2可知，对黑曲霉WS003产果胶酶影响因素从大到小的顺序依次为：菠萝皮添加量、pH和磷酸氢二钾。分析结果表明A2B3C1为最佳组合，即菠萝皮添加量为0.15 g/10 g干基、pH为6.0、磷酸氢二钾浓度为0.2%，在此条件下，果胶酶活力可达81.06 U/mL。

3 结论

利用单因素试验确定了黑曲霉WS003的培养条件：碳氮比为40∶1、菠萝皮为诱导物、磷酸氢二钾为无机营养盐；通过正交试验进一步优化了培养条件。结果表明：菠萝皮的添加量为0.15 g/10 g干基、发酵为pH 6.0、磷酸氢二钾浓度为0.2%时，果胶酶活力最高，达到81.06 U/mL。

[1]蒋红菊，杨加志，宋加妹，等.高产果胶酶菌株选育及发酵产酶条件优化的研究进展[J].中国酿造，2010,224(11)：1.

[2]程红，杜国军，刘晓兰，等.黑曲霉HY-M27产果胶酶固态发酵条件的优化[J].中国调味品，2012,37(12)：24.

[3]白爱枝，闫祖威，梁运章，等.黑曲霉产纤维素酶液体发酵条件的优化[J].食品科技，2008,32(3)：12.

[4]贺莹，高丽芳，焦红英.黑曲霉产糖化酶固态发酵营养条件优化研究[J].中国酿造，2013,32(9)：88.

[5]王丽丽，刘晓兰，郑喜群，等.黑曲霉固态发酵产生果胶酶条件的优化[J].食品科技，2008,32(5)：14.

[6]杨欣伟，林伟铃，田宝玉，等.果胶酶高产菌株EIM-6的筛选鉴定及其液体发酵产酶条件优化[J].福建师范大学学报，2009，25(2)：69.

Optimization ofAspergillusnigerWS003 Producing Pectinase Conditions by Solid-state Fermentation Method

ZHANG Zhong-ping1, YANG Xu2,3*

(1.Harbin Testing Center for Food Quality and Safety,Harbin 150036,China; 2.Harbin Food Industry Institute,Harbin 150025,China;3.Harbin Food Industry Institute Co.,Ltd.,Harbin 150025,China)

Use soybean meal and wheat bran as main culture medium andAspergillusnigerWS003 as the fermentation strain,adopt solid-state fermentation method to produce pectinase.The single factor experiments are used to improve the fermentation conditions:the ratio of carbon and nitrogen is 40∶1, use pineapple peel as inducer and K2HPO4as inorganic salt.The orthogonal experiments are adopted to optimize the culture conditions.The results show that the optimal conditions of culture medium are as follows: additive amount of pineapple peel is 0.15 g/10 g dry basis,fermentation pH is 6.0, the concentration of K2HPO4is 0.2%.Under these conditions, the enzyme activity of pectinase is the highest,which can reach 81.06 U/mL.

Aspergillusniger；solid-state fermentation；pectinase

2017-03-10 *通讯作者

杨旭(1970-)，男，山东莱州人，高级工程师，研究方向：食品工程。

TS264.2

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.09.013

1000-9973(2017)09-0058-03