杜兵兵

(漯河医学高等专科学校，河南 漯河 462002)

纤维素酶辅助提取花椒挥发油工艺及其抗氧化作用的研究

杜兵兵

(漯河医学高等专科学校，河南 漯河 462002)

采用纤维素酶辅助提取花椒挥发油，在单因素试验基础上，设计正交试验。分析各个因素的显著性，得出纤维素酶辅助提取花椒挥发油的最佳工艺条件：纤维素酶的添加量为2%，预处理温度为40 ℃，预处理时间为2 h，pH为4.6。在此条件下，花椒挥发油得率为11.58%。而且花椒挥发油对DPPH自由基具有一定的清除能力，EC50为9.611 mg/mL。

花椒；挥发油；纤维素酶；提取工艺；抗氧化

花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim.)为芸香科植物，为药食两用芳香植物，很多文献显示：花椒中含有丰富的挥发油，具有调味、抗菌和杀虫等功效[1]。目前关于花椒挥发油的提取主要侧重水蒸气蒸馏法、超临界CO2流体萃取法、超声辅助溶剂萃取法和无溶剂微波蒸馏法[2,3]。而纤维素酶辅助提取挥发油为近几年出现的提取方法，其中纤维素可以降解植物细胞壁，促进细胞活性成分有效溶出，提高提取率[4]。本研究利用纤维素酶酶解作用辅助提取花椒挥发油，采用L9(34)正交试验优选最佳工艺，并对挥发油抗氧化作用进行研究，为花椒的开发和利用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

花椒：采自河南省漯河市北舞渡镇，经鉴定为芸香科植物花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim.)的干燥成熟果实；纤维素酶：宁夏夏盛实业集团有限公司，活力单位11000 U/g；石油醚、无水硫酸钠等：均为分析纯。

AB135-S型电子分析天平 瑞士Mettler-Toledo 公司；98-1-B型电加热套 天津市泰斯特仪器有限公司；RE-52A型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；SHB-III型循环水式真空泵 巩义市科学仪器有限公司；HH-4型恒温水浴锅 金坛市宏华仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 挥发油的提取

将花椒粉末50 g置于100 mL烧瓶中。依据实验设计，加入适量纤维素酶液，在一定的pH、温度条件下酶解预处理一定时间，然后按水蒸气蒸馏法提取3 h，蒸馏液以石油醚萃取，萃取物加无水硫酸钠静置脱去水分，减压旋蒸法去除石油醚，得花椒挥发油，称重计算挥发油得率。挥发油得率(%)=挥发油重量/花椒重量×100%。

1.2.2 单因素试验

设定酶的添加量为0.5%，1%，1.5%，2%，2.5%，3%、温度为40 ℃，预处理2 h后参照1.2.1项进行挥发油提取，并计算得率；设定酶的添加量为2%、温度为30，40，50，60，70，80 ℃，预处理2 h后参照1.2.1项进行挥发油提取，并计算得率；设定酶的添加量为2%、温度为40 ℃、预处理时间为1，2，3，4，5，6 h，参照1.2.1项进行挥发油提取，并计算得率；设定酶的添加量为2%、温度为40 ℃、pH为4.1，4.6，5.1，5.6，6.1，6.6，预处理2 h后参照1.2.1项进行挥发油提取，并计算得率。

1.2.3 正交试验

根据单因素试验结果，选取酶添加量(1%，1.5%，2%)、酶解温度(40，50，60 ℃)、时间(1，2，3 h)、酶解pH(4.1，4.6，5.1)，4个因素设计L9(34)正交试验，以挥发油得率为考察指标。

1.2.4 花椒挥发油清除DPPH自由基活性测定

吸取0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液3 mL置于试管中，加入1 mL不同质量浓度的挥发油的95%乙醇溶液1 mL，混合液在室温下静置30 min，于517 nm处测定吸光度A1，用同体积的95%乙醇溶液代替待测液，测定吸光度A2，同体积的95%乙醇溶液代替DPPH乙醇溶液，测定吸光度A0，以VC作为对照，计算清除率，清除率(%)=[1-(A1-A0)/A2]×100%[5]。

2 结果

2.1 单因素试验结果

2.1.1 酶添加量对挥发油得率的影响

图1 酶添加量对挥发油得率的影响

由图1可知，伴随纤维素酶添加量的增加，挥发油得率不断增大，但是当纤维素酶添加量大于2%时，花椒挥发油的得率变化幅度降低，提示纤维素酶添加量达到2%时，底物与纤维素酶已经结合，增加纤维素酶浓度，已没有多余的底物与其结合，提取率不再改变。

2.1.2 预处理温度对挥发油得率的影响

图2 温度对挥发油得率的影响

由图2可知，伴随预处理温度的增加，花椒挥发油的得率明显增加，当辅助提取温度超过40 ℃时，挥发油的得率开始下降，可能是高温降低了纤维素酶的活性。

2.1.3 预处理时间对挥发油得率的影响

图3 时间对挥发油得率的影响

由图3可知，伴随时间的增加，花椒挥发油的得率明显增加，当预处理时间达到2 h时，挥发油的得率最高，然后延长时间，得率变化幅度不明显。

2.1.4 预处理pH对挥发油得率的影响

图4 pH对挥发油得率的影响

由图4可知，随着pH的增加，花椒挥发油的得率明显上升，当预处理pH达到4.6时，花椒挥发油的得率最高，然后伴随pH的增加，得率明显下降，可能与酶的最佳pH有关，过酸过碱均会影响酶的活性。

2.2 正交试验结果

表1 正交试验结果

表2 方差分析

注：F0.05(2，2)=19.00，F0.01(2，2)=99.00。

由表1和表2可知，各因素对挥发油得率影响大小的顺序为酶添加量>温度>pH>时间，其中酶添加量对花椒挥发油得率影响显著。最佳酶辅助提取工艺组合为A3B1C2D2，即酶添加量为2%、预处理温度为40 ℃、时间为2 h、pH为4.6。

2.3 不同预处理方法对花椒挥发油得率的比较

表3 不同预处理方法对花椒挥发油得率的比较

由表3可知，以纤维素酶辅助最佳提取工艺组合进行预处理，花椒挥发油得率可达11.58%，高于温水浸泡预处理法和直接蒸馏法。

2.4花椒挥发油清除DPPH自由基活性测定

图5 清除DPPH自由基活性测定

由图5可知，花椒挥发油对DPPH自由基清除能力低于VC，其中VC对DPPH自由基的EC50为5.750 mg/mL，花椒挥发油对DPPH自由基的EC50为9.611 mg/mL。

3 讨论

本试验应用纤维素酶预处理法辅助提取花椒挥发油，并探讨了花椒挥发油的抗氧化活性，结果表明：最佳辅助提取工艺为纤维素酶添加量2%、预处理温度40 ℃、预处理时间2 h、pH 4.6，其中酶的添加量对花椒挥发油得率影响显著。采用最佳预处理工艺路线，花椒挥发油得率为11.58%，明显高于温水浸泡预处理法和直接蒸馏法。而且花椒挥发油清除DPPH自由基活性测定也显示花椒挥发油对DPPH自由基具有一定的清除能力，EC50为9.611 mg/mL。

[1]韩胜男，李妍，张晓杭，等.花椒挥发油的提取工艺优化及抗肿瘤活性分析[J].食品科学，2014，35(18):13-16.

[2]杨潇，芮光伟，蒋珍菊，等.三种不同方法提取花椒挥发油中化学成分的GC/MS/AMDIS比较分析[J].中国调味品，2014，39(5):118-121，133.

[3]孙可可，尹艳红，邢晓晓，等.不同加工温度和时间对超临界花椒精油品质的影响[J].中国调味品，2017，42(2):134-136，141.

[4]张辰露，张晓娟，朱双全，等.Box-Behnken响应面法优化纤维素酶提取紫苏叶挥发油工艺[J].中成药，2016，38(9):2055-2059.

[5]张玲玲，张鹏，李士明，等.酿酒酵母检验黑胡椒挥发油抗氧化活性研究[J].食品科学，2016，37(23):51-56.

Study on Process of Cellulase Assisted Extraction of Volatile Oil fromZanthoxylumbungeanumMaxim. and Its Antioxidation Effect

DU Bing-bing

(Luohe Medical College, Luohe 462002, China)

Cellulase is used for assisted extraction of volatile oil fromZanthoxylumbungeanumMaxim. and orthogonal experiment is designed on the basis of single factor experiment. The optimum conditions are as follows: the additive amount of cellulase is 2%, the pretreatment temperature is 40 ℃, the pretreatment time is 2 h and the pH value is 4.6. Under such conditions, the yield of volatile oil is 11.58%, and the volatile oil ofZanthoxylumbungeanumMaxim. has certain scavenging ability to DPPH free radical, EC50is 9.611 mg/mL.

ZanthoxylumbungeanumMaxim.；volatile oil；cellulase；extraction process；antioxidation

2017-03-11

杜兵兵(1982-)，男，讲师，在读博士，主要从事应用化学方面的研究。

TS264.2

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.09.012

1000-9973(2017)09-0055-03