汪晓琳

(江苏食品药品职业技术学院，江苏 淮安 223003)

黑胡椒中胡椒碱的提取及抗氧化性研究

汪晓琳

(江苏食品药品职业技术学院，江苏 淮安 223003)

对胡椒碱的提取工艺及抗氧化性进行了研究。以黑胡椒为原料，采用正交试验设计考察了乙醇浓度、料液比、超声功率和超声时间对胡椒碱提取工艺的影响，并对胡椒碱抗氧化性能进行了初步研究。结果表明：胡椒碱最佳提取工艺为乙醇浓度80%、料液比1∶20、超声功率700 W、超声时间80 min，该工艺条件下胡椒碱的提取率达到5.43%；提取的胡椒碱具有很好的抗氧化活性，且呈现明显的量效关系，当胡椒碱的浓度为6 mg/mL时，对DPPH自由基和超氧阴离子的清除率分别达到72.6%和54.7%。

黑胡椒；胡椒碱；正交试验；超声提取

胡椒(PipernigrumL.)，别名昧履支、坡洼热，是胡椒科、胡椒属攀援藤本植物，其果实晒干后呈黑褐色，称为黑胡椒。黑胡椒是一种重要的热带香辛作物，也是我国广大人民非常喜欢的调味品之一[1]。医学研究表明胡椒具有温中、下气、消痰、解毒之功效，可用于消化不良、咳嗽、支气管炎、腹痛泄泻等症状[2,3]。在食品工业中，胡椒也广泛用于腌制品的防腐性香料[4]。

胡椒碱(piperine) 是黑胡椒中的主要生理活性成分之一，属于桂皮酰胺类生物碱，具有抗惊厥、抗癌、抗氧化、抗炎、促进药物吸收等多种药理学活性[5]。目前胡椒碱的提取方法主要有酸水提取法、有机溶剂提取法、微波提取法、超声波提取法等[6,7]。超声波提取是利用超声波产生高速、强烈的空化效应和机械效应，增大细胞膜和细胞壁的通透性以提取其生物活性成分。该法不仅可以缩短提取时间，而且降低溶剂用量和能耗，提高提取效率[8]。由于超声波提取操作简单，运行成本低，经济效应显著，目前已经广泛用于中药及天然药物中各种活性成分的提取[9,10]。

随着人民生活水平和健康意识的提高，食品安全已经成为全社会关注的焦点。食品加工中广泛使用的抗氧化剂对健康的潜在影响引起医学专家和消费者的担忧，因此开发天然抗氧化剂势在必行。本文对超声波提取胡椒碱的工艺进行优化，并通过体外对DPPH自由基、超氧阴离子自由基的清除来评价胡椒碱的抗氧化性能，为新型天然抗氧化剂的研发提供一定理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1.1.1 主要试剂

黑胡椒 市售；胡椒碱标准品 四川省维克奇生物科技有限公司；DPPH自由基 Sigma公司；邻苯三酚 上海展云化工有限公司；无水乙醇 苏州欧特化工有限公司。

1.1.2 主要仪器

LC-2900 型高效液相色谱仪 上海天普分析仪器有限公司；PC1200N 型超声波细胞粉碎机 冠森生物科技(上海)有限公司；XB220A型电子天平 瑞士PRECISA公司；RE-52A型旋转蒸发仪 上海政泓实业有限公司；TV1901型分光光度计 上海奥析科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 胡椒碱的提取

将黑胡椒放入50 ℃的恒温干燥箱干燥3 h，用粉碎机粉碎，过40目筛，得黑胡椒粉末。称取10.0 g黑胡椒粉末，以一定的料液比加入不同浓度乙醇溶液，室温下浸渍2 h，然后在一定功率下的超声波细胞粉碎机中提取一定时间，过滤，置于60 ℃的水浴锅中减压浓缩，真空干燥后得胡椒碱粉末。

1.2.2 胡椒碱的检测

1.2.2.1 高效液相色谱法的色谱条件

C18色谱柱(4.6 mm×200 mm×5 μm)，流动相甲醇-水(70∶30)，流速0.8 mL/min，检测波长343 nm，柱温为常温，进样量10 μL。

1.2.2.2 标准曲线

精密称取胡椒碱标准品50 mg，置于50 mL容量瓶中，用无水乙醇溶解并稀释至刻度，吸取标准品溶液1.0,2.0,4.0,6.0,8.0 mL，分别置于10 mL容量瓶中，无水乙醇稀释至刻度，摇匀。按色谱条件进样检测，以对照品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：Y=29485.54 X-497.27，r=0.9983。

1.2.2.3 胡椒碱的测定

称取1.2.1中的胡椒碱粉末5 mg，置于10 mL容量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度；0.22 μm的滤膜过滤，进样检测，外标法计算胡椒碱的含量。胡椒碱的提取率(%)=胡椒碱重量/反应黑胡椒粉末重量×100%。

1.2.3 胡椒碱对DPPH自由基清除能力的测定

采用分光光度法[11]，将胡椒碱用无水乙醇稀释成浓度为1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mg/mL的溶液。分别吸取各待测样品溶液2 mL，加入2 mL 2×104mol/L DPPH自由基溶液中，混匀后水浴保温30 min，于517 nm处测定吸光度Ai。按前述方法同时测定2 mL无水乙醇与2 mL DPPH自由基混合溶液的吸光度A0，2 mL无水乙醇与2 mL各待测样品混合溶液的吸光度Aj。按照下式计算胡椒碱对DPPH自由基的清除率。

DPPH自由基清除率(%)=[ A0-(Ai-Aj)]/A0×100%。

1.2.4 胡椒碱对超氧阴离子清除能力的测定

采用邻苯三酚自氧化法[12]，向试管中依次加入pH 8.2的Tris-HCl缓冲液6 mL、胡椒碱溶液0.5 mL，25 ℃水浴20 min，再加入同温度下预热过的7 mmol/L的邻苯三酚盐酸溶液1 mL，溶液震荡混匀，静置4 min，加入0.5 mL的浓盐酸溶液终止反应，以10 mmol/L的盐酸溶液作为参比，测定325 nm处的吸光度值A1。同时，用盐酸溶液代替样液，测定325 nm处空白溶液的吸光度A0，按下式计算样品对超氧阴离子的清除率。

超氧阴离子清除率(%)=(A0- A1)/A0×100%。

2 结果与讨论

2.1 单因素优化试验

2.1.1 乙醇浓度对胡椒碱提取率的影响

按1.2.1所述的方法，称取黑胡椒各10.0 g，以料液比(g/mL)1∶10分别加入60%，70%，80%，90%，100%的乙醇100 mL，在500 W超声功率下提取40 min，考察乙醇浓度对胡椒碱提取率的影响，结果见图1。

图1 乙醇浓度对胡椒碱提取率的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of piperine

由图1可知，随着乙醇浓度的增加，胡椒碱提取率不断提高，当乙醇浓度为80%时，胡椒碱提取率达到最大(3.92%)，随后开始下降。这是由于胡椒碱和乙醇之间存在“相似相溶”，提取率增加；当乙醇浓度过高时，二者之间功能基团相互排斥，胡椒碱提取率随之下降。因此，选择80%乙醇较佳。

2.1.2 料液比对胡椒碱提取率的影响

按1.2.1所述的方法，称取黑胡椒各10.0 g，分别以料液比1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30 (g/mL)加入80%乙醇，在500 W超声功率下提取40 min，考察料液比对胡椒碱提取率的影响，结果见图2。

图2 料液比对胡椒碱提取率的影响Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of piperine

由图2可知，胡椒碱提取率随着料液比的增加而增加，当料液比达到1∶20后，胡椒碱提取率增加缓慢。这是因为料液比低时，胡椒碱在溶剂中容易达到饱和，抑制胡椒碱的释放；料液比较高时有利于胡椒碱的释放；当料液比过高时容易造成溶剂的浪费。因此，选择料液比1∶20较为合适。

2.1.3 超声功率对胡椒碱提取率的影响

按1.2.1所述的方法，称取黑胡椒各10.0 g，以料液比1∶20 (g/mL)加入80%乙醇，在300，400，500，600，700，800 W超声功率下提取40 min，考察超声功率对胡椒碱提取率的影响，结果见图3。

图3 超声功率对胡椒碱提取率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic power on the extraction rate of piperine

由图3可知，随着超声功率的增加，胡椒碱提取率呈先快速增加而后缓慢下降的趋势，当超声功率为600 W时，胡椒碱的提取率最高，达到4.52%。这是因为超声功率过大时，升温过快，容易造成胡椒碱的降解，使得提取率下降。因此，选择超声功率600 W为宜。

2.1.4 超声时间对胡椒碱提取率的影响

按1.2.1所述的方法，称取黑胡椒各10.0 g，以料液比1∶20 (g/mL)加入80%乙醇，在600 W的功率下分别超声40，60，80，100，120 min，考察超声时间对胡椒碱提取率的影响，结果见图4。

图4 超声时间对胡椒碱提取率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic time on the extraction rate of piperine

由图4可知，随着时间的延长，胡椒碱提取率呈现先升后降的 “倒V型”趋势；当超声80 min时，胡椒碱提取率达到最大，为4.89%。延长超声时间可以提高胡椒碱提取含量，但是时间过长可能出现胡椒碱降解情况，导致胡椒碱提取率下降，同时杂质增加。因此，选择时间为80 min较佳。

2.2 正交试验设计

根据2.1中单因素试验结果，对乙醇浓度、料液比、超声功率和超声时间4个因素进行正交试验设计，以期获得最佳的胡椒碱提取工艺，试验设计因素水平表见表1。

表1 胡椒碱提取正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment of piperine extraction

正交试验结果及方差分析见表2和表3。

表2 胡椒碱提取正交试验设计与结果Table 2 Design and results of orthogonal experiment of piperine extraction

续 表

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis table

根据表2极差R值大小可知影响胡椒碱提取率的各因素主次顺序为A>C>D>B，即乙醇浓度>超声功率>超声时间>料液比。根据K值可以得出胡椒碱的最佳提取条件为A2B2C3D2，即乙醇浓度80%、料液比1∶20、超声功率700 W、超声时间80 min。在此条件下，进行3批工艺验证，胡椒碱的提取率达到5.43%。

由表3可知，因素A和因素D的F值都大于F临界值，可知因素A(乙醇浓度)和因素D(超声功率)对胡椒碱的提取有显著的影响，是胡椒碱提取工艺中的关键参数。

2.3 胡椒碱抗氧化性能测定

本实验选择对DPPH自由基、超氧阴离子的清除率作为评价胡椒碱抗氧化性能的指标，实验结果见图5。

图5 胡椒碱对DPPH自由基和超氧阴离子的清除作用Fig.5 Scavenging effects of piperine on DPPH free radical and superoxide anion

由图5可知，胡椒碱对DPPH自由基和超氧阴离子均有较好的清除作用，且胡椒碱对DPPH自由基和超氧阴离子的清除率随着浓度的增加而逐渐上升，存在明显的量效关系。当胡椒碱的浓度为6 mg/mL时，对DPPH自由基和超氧阴离子的清除率分别达到72.6%和54.7%，由此可见，本实验提取的胡椒碱具有良好的抗氧化性能。

3 结论

胡椒是古老而著名的调味香料，广泛用于烹饪调料，在医药和食品工业也具有很多用途。胡椒碱是黑胡椒的主要活性物质之一，近年来引起学者和企业界的广泛关注，对胡椒碱的生物活性和药理作用的研究非常活跃[13,14]。本研究以黑胡椒为原料，采用正交试验设计对超声提取胡椒碱的工艺进行了优化，并对胡椒碱抗氧化性能进行了初步研究。得到胡椒碱的最佳提取条件为：乙醇浓度80%、料液比1∶20、超声功率700 W、超声时间80 min，该工艺条件下胡椒碱的提取率达到5.43%；提取的胡椒碱对DPPH自由基、超氧阴离子具有很好的抑制率，呈现明显的量效关系，且当胡椒碱的浓度为6 mg/mL时，对DPPH自由基和超氧阴离子的清除率分别达到72.6%和54.7%，可见胡椒碱具有很好的抗氧化活性。这为胡椒碱作为天然抗氧化剂的开发提供了很有意义的基础。

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Study on the Extraction and Antioxidant Activity of Piperine fromPipernigrum

WANG Xiao-lin

(Jiangsu Food & Pharmaceutical Science College，Huai'an 223003, China)

In this paper, the extraction technology and antioxidant activity of piperine are studied. WithPipernigrumas raw material, the effects of ethanol concentration, solid-liquid ratio, ultrasonic power and ultrasonic time on the extraction technology of piperine are studied by orthogonal test design, and the antioxidant activity of piperine is also investigated. The results show that the optimum extraction process of piperine is ethanol concentration of 80%, solid-liquid ratio of 1∶20, ultrasonic power of 700 W, ultrasonic time of 80 min, the extraction rate of piperine reaches 5.43% under such conditions. The extracted piperine has good antioxidant activity, and it shows an obvious dose-effect relationship. When the concentration of piperine is 6 mg/mL, the scavenging rates of DPPH radical and superoxide anion are 72.6% and 54.7% respectively.

Pipernigrum；piperine；orthogonal test；ultrasonic extraction

2017-03-10

汪晓琳(1979-)，女，讲师，硕士，研究方向：食品加工。

TS264.2

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.09.011

1000-9973(2017)09-0051-04