朱燕，赵洁，刘兵，符继红

(新疆大学理化测试中心，乌鲁木齐 830046)

基于GC-MS结合偏最小二乘判别分析的薰衣草精油指纹图谱研究

朱燕，赵洁，刘兵，符继红*

(新疆大学理化测试中心，乌鲁木齐 830046)

建立气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术测定薰衣草精油的方法，分析了新疆法国蓝和C-197(2)2个不同品种的21批薰衣草精油样品，并基于该方法建立了薰衣草精油的指纹图谱。以GC-MS结合保留指数对复杂未知物进行定性分析，共确定了26个共有峰。采用偏最小二乘判别分析(PLS-DA)对训练集样本进行模式识别，根据模型的变量权重系数(VIP)筛选出了对品种的分类具有较大贡献的潜在标志物。并通过PLS-DA模型对7个未知样品进行预测，2个品种的薰衣草精油的均方根预测偏差(RMSPE)均为0.1323，模型对验证集中薰衣草样本的判别准确率为100%。结果表明：该方法精密度好，简单快速，为新疆薰衣草精油的品种鉴定与质量评估提供了可靠的依据。

薰衣草精油；指纹图谱；分类；偏最小二乘判别分析

薰衣草(LavandulaangustifoliaMill.)，系唇形科薰衣草属植物[1,2]。我国薰衣草的主要栽培地区是新疆的伊犁，是世界三大薰衣草基地之一[3]。薰衣草除了作为一种传统中药，还是一种重要的天然香料植物[4-6]。薰衣草精油香味浓郁而柔和，无毒副作用，作为食品添加剂，既可以使食品具有特殊风味，又具有保健价值，被广泛地应用[7]。目前市场上由于不同品种混种、混收，加上人工法合成精油非常容易，导致以次充好的现象时有发生，而应用于食品的精油需要更严格的质量保证。因此对薰衣草进行系统的研究，建立薰衣草精油的质量控制体系是非常必要的。薰衣草精油的化学成分极为复杂，不同品种薰衣草精油的化学成分和含量存在较大的差异。天然产物质量控制是一项十分复杂的研究，中药指纹图谱技术目前已成为国际公认的控制天然产物质量的最有效手段[8-10]。指纹图谱的特点是复杂、信息量极大，采用化学计量学方法可以很好地解决指纹图谱数据的复杂解析问题。本文采用水蒸气蒸馏法提取薰衣草精油，应用GC-MS技术建立薰衣草精油的分析方法，并结合保留指数对薰衣草精油的化学成分进行鉴定。采用偏最小二乘判别分析(PLS-DA)对新疆不同品种的薰衣草精油指纹图谱进行分析，从而为新疆薰衣草精油的品种判别和质量控制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

Aglient 7890B GC-5977A MSD气相色谱-质谱联用仪 美国安捷伦公司；Sartorius BS124S AG电子天平 德国赛多利斯公司；21批薰衣草样品采集于新疆伊犁，分为法国蓝(A1～A13)和C-197(2)(B14～B21)，样品被分成训练集样品(共14个，包括9个法国蓝样本A1～A9，5个C-197(2)样本B1～B5)和验证集样本(共7个，包括4个法国蓝样本A10～A13，3个C-197(2)样本B6～B8)；正构烷烃标准品C5～C24上海试剂一厂；无水硫酸钠(分析纯) 天津市河东区红岩试剂厂。

1.2 实验方法

1.2.1 薰衣草精油提取

准确称取30 g干燥的薰衣草花样品，置于1 L圆底烧瓶中，加入420 mL蒸馏水，用挥发油提取器提取4 h，得到黄色透明、具有特殊浓郁气味的精油，用无水硫酸钠干燥后低温密封保存。

1.2.2 GC-MS分析条件

色谱柱为HP-INNOWax毛细管柱(60 m×0.25 mm，0.5 μm)；程序升温：初始温度50 ℃，以3 ℃/min升温至200 ℃，再以5 ℃/min 升温至250 ℃，保持3 min；进样口温度250 ℃；载气(He)流速1.0 mL/min；进样量0.4 μL；分流比30∶1。离子源温度230 ℃；EI源电离能量70 eV；传输线温度250 ℃；质量扫描范围30～550 m/z。

1.2.3 保留指数的测定

取C5～C24正构烷烃标准品，采取与样品相同的分析条件，测定正构烷烃的保留时间。根据保留指数计算公式计算化合物的保留指数(RI)。通过谱库检索、化合物保留指数的计算值与NIST数据库在相同色谱柱HP-INNOWax上的RI文献检索值比对，对薰衣草精油组分进行准确定性。

1.2.4 数据分析

数据通过EXCEL，SIMCA-P13.0软件进行处理计算。PLS-DA分析方法首先对分类变量和数据进行PLS分析，建立类别判别回归模型，然后根据所建立模型计算验证集的分类变量(Yp)，当Yp>0.5，且偏差<0.5时，判定属于该类；当Yp<0.5，且偏差<0.5时，判定不属于该类；偏差≥0.5时，判别不稳定。

1.2.5 方法学考察

1.2.5.1 精密度实验

取同一薰衣草精油样品，在GC-MS色谱条件下连续进样5次。以乙酸芳樟酯(14号峰)为参照峰，计算共有色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值。结果表明：共有色谱峰的相对保留时间的RSD均小于1%，相对峰面积的RSD小于3%，表明仪器的精密度良好。

1.2.5.2 重复性实验

取同一批薰衣草样品5份，按上述实验方法提取薰衣草精油，在GC-MS色谱条件下进行测定。以乙酸芳樟酯(14号峰)为参照峰，计算共有色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值。结果表明：共有色谱峰的相对保留时间的RSD均小于1%，相对峰面积的RSD小于5%，表明方法的重复性良好。

1.2.5.3 稳定性实验

取同一薰衣草精油样品，在GC-MS色谱条件下分别在0，2，4，6，8，10，24 h进样测定。以乙酸芳樟酯(14号峰)为参照峰，计算共有色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值。结果表明：共有色谱峰的相对保留时间的RSD均小于1%，相对峰面积的RSD小于3%，表明薰衣草精油在24 h内稳定性良好。

2 结果与分析

2.1 薰衣草精油GC-MS指纹图谱的建立

分别称取21批薰衣草样品，按2.1项下方法制得薰衣草精油，按2.2项下色谱条件进样检测，指纹图谱色谱图见图1。

图1 21批薰衣草精油GC-MS指纹图谱Fig.1 GC-MS fingerprint spectrum of 21 batches spectrum of lavender essential oils

对数据进行处理，从21批薰衣草精油GC-MS指纹图谱中共匹配出26个共有峰，且共有峰面积之和大于总峰面积的90%以上。将21批样品色谱峰的响应信号的平均值作为共有模式，建立薰衣草精油GC-MS的对照指纹图谱，见图2。

图2 薰衣草精油GC-MS的对照指纹图谱Fig.2 GC-MS reference fingerprint spectrum of lavender essential oils

其中，乙酸芳樟酯(14号峰)的色谱峰在色谱图中较稳定，峰面积较大，因此确定为参照峰，其余共有峰与乙酸芳樟酯的相对保留时间的RSD值在0.159%～0.585%之间。对各批次样品与对照指纹图谱之间的相似度进行计算。目前对中药指纹图谱相似度的计算方法有向量夹角余弦法和相关系数法。向量夹角余弦法是将指纹图谱的相似度问题转换成多维空间中的两个向量的相似性问题，而相关系数法是对不同批次样品的同种属性进行相似度比较[11]。本文以向量夹角余弦和相关系数法为测度，经过计算21批样品与对照指纹图谱的相似度在0.904～0.990之间，计算结果见表1。

表1 21批薰衣草精油指纹图谱的相似度Table 1 Similarities of fingerprint spectrum of 21 batches lavender essential oils

结果表明：21批薰衣草精油样品的相似度均大于0.900，表明整体相似度良好。

2.2 共有峰的归属

由于精油复杂多变的化学成分，仅依靠质谱的匹配度来确定相应的化合物存在一定的不确定性。将样品质谱图经计算机数据库检索，结合保留指数RI进行验证，可极大提高鉴定结果的准确性。对薰衣草精油指纹图谱中的26个共有色谱峰进行归属，鉴定结果见表2。结果表明：薰衣草精油的主要成分为芳樟醇(相对峰面积0.789～2.713)和乙酸芳樟酯(相对峰面积1)，是含量最高的2个化合物。同时，21批薰衣草精油中的26个共有特征峰的峰面积变化较大，表明不同样品的薰衣草精油中化学成分的含量存在一定的差异。

表2 薰衣草指纹图谱中的共有峰成分分析Table 2 Component analysis of common peaks in fingerprint spectrum of lavender essential oils

续 表

注：文献值为HP-INNOWax色谱柱上的保留指数；“-”表示文献未报道。

2.3 PLS-DA判别模型的建立与验证

本实验以薰衣草样品中26个共有化合物的相对面积的百分含量为X变量，以训练集样品的品种类别为Y变量，按照法国蓝和C-197(2)的实际品种类别，将Y变量人工分为2类，并对样本进行有监督的PLS-DA分析。法国蓝和C-197(2)2个品种的PLS-DA的得分图见图3a，从图中可以看出2个品种的薰衣草样品明显被分开。其中R2Y=0.975，Q2=0.734，模型验证结果表明该模型稳定，预测能力好，建模成功。变量权重系数(VIP)值可以量化由PLS-DA的每个变量对样品分类的贡献，VIP>1的变量被认为是贡献较大的变量。由PLS-DA的VIP得分图3b中可以发现有8个变量的VIP值大于1，变量对分类的贡献依次为乙酸薰衣草酯>乙酸芳樟酯>β-檀香萜醇>桉油精>乙酸己酯>枯茗醛>莰烯>β-罗勒烯，而乙酸薰衣草酯和乙酸芳樟酯是对分类具有最大贡献的2个化合物。

图3 法国蓝和C-197(2)样品的PLS-DA得分图(a)和VIP得分图(b)Fig.3 PLS-DA score plot (a) and variable importance plot (b) of French blue and C-197(2) samples

利用PLS回归分析方法对训练集样本的26个共有化合物的相对面积百分含量与分类变量进行回归分析，并建立共有成分与分类变量的PLS回归模型。所有训练集样本法国蓝和C-197(2)分类变量的PLS预测值与实测值的回归图见图4，图中的直线为模型校正结果与实际分类间的回归线，分类变量的实测值和模型的预测值的相关系数为0.975，样品辨别率为100%，说明模型的拟合较好。

图4 PLS-DA校正模型样本分类变量的PLS预测值与实测值的回归图Fig.4 Regression plot of reference and prediction category variables of sample by PLS-DA model

由图4可知，模型将法国蓝和C-197(2)样本区分开，即校正样品分散在实测值等于1线上的法国蓝品种样品点和实际值等于0线上C-197(2)品种的样本点能明显分开，结果表明PLS-DA模型具有很高的可靠性，可以用于检验和判别新的样品。

利用PLS-DA判别分析方法建立的薰衣草品种分类模型，对验证集中的7个未参加建模的样本(4个法国蓝样本A10～A13，3个C-197(2)样本B6～B8)进行判别分析，法国蓝样本特征的预测结果见图5。法国蓝品种的薰衣草精油的均方根预测偏差(RMSPE)为0.1323，其中验证集中所有的法国蓝样本的分类变量(Yp)的预测值都接近于1，偏差在0.1左右；C-197(2)的分类变量的预测值基本为0，偏差均小于0.3。根据PLS-DA方法的判别准则Yp>0.5且偏差<0.5可知，验证集所有的法国蓝样本均被正确识别，而C-197(2)样本不具有法国蓝样本的特征，说明PLS-DA判别模型对样本的判别准确率为100%。采用上述已建立的PLS-DA模型对C-197(2)样本特征进行预测，C-197(2)品种的薰衣草精油的均方根预测偏差(RMSPE)为0.1323，结果表明模型对验证集中的C-197(2)样本的判别准确率为100%。

图5 验证集中薰衣草样品的PLS-DA模型的判别结果Fig.5 Discriminant results of lavender sample in validation set by PLS-DA model

注：A表示法国蓝，B表示C-197(2)。

3 结论

本实验应用GC-MS法建立了薰衣草精油的指纹图谱，该方法简单快速，精密度好，可用于薰衣草精油的指纹图谱分析。采用GC-MS分析方法，对新疆薰衣草(法国蓝和C-197(2))共21批精油样品进行指纹图谱分析，结合保留指数共确定了26个共有峰，样品相似度均在0.900以上。采用PLS-DA对验证集中薰衣草样品进行模式识别，从中筛选出的 特征变量被确认为潜在标志物，可以作为薰衣草精油不同品种鉴定的标志性化合物，通过PLS-DA模型对7个验证集样品进行预测，正确识别率为100%。因此该方法可以为新疆薰衣草精油的品种判别和质量控制提供科学依据。

[1]徐洁华,文首文.薰衣草挥发性有机物及其药理功效研究进展[J].时珍国医国药,2010,21(4):979-980,983.

[2]张秋霞,江英,张志强.薰衣草精油的研究进展[J].香料香精化妆品,2006(6):21-24.

[3]游海丽.伊犁地区薰衣草产业发展现状及经营对策[J].新疆教育学院学报,2007,23(3):129-133.

[4]Rafie S,Namjoyan F,Golfakhrabadi F,et al.Effect of lavender essential oil as a prophylactic therapy for migraine: a randomized controlled clinical trial[J].Journal of Herbal Medicine,2016,6(1):18-23.

[5]张云,陈计峦,刘绪广,等.超声波提取薰衣草精油的研究[J].食品研究与开发,2007(12):81-83.

[6]Silva G L,Luft C,Lunardelli A,et al.Antioxidant,analgesic and anti-inflammatory effects of lavender essential oil[J].Anais Da Academia Brasileira De Ciencias,2015,87(2):1397-1408.

[7]Porto C,Decorti D,Kikic I.Flavour compounds ofLavandulaangustifoliaL.to use in food manufacturing: comparison of three different extraction methods[J].Food Chem.,2009,112(4):1072-1078.

[8]韩晔华,霍飞凤,杨悠悠,等.中药指纹图谱研究的某些进展与展望[J].色谱,2008,26(2):142-152.

[9]梁现蕊,肖钦钦.静态顶空-气相色谱法用于柳叶蜡梅挥发油指纹图谱研究[J].浙江工业大学学报,2015,43(5):567-572.

[10]闫玉娇,吴佩颖.基于指纹图谱技术的银杏叶黄酮类成分分析研究进展[J].中成药,2016,38(5):1123-1127.

[11]王栋,王永禄,郭啸,等.中药金礞石红外指纹图谱相似度分析[J].光谱学与光谱分析,2011,31(10):2715-2718.

Research on Fingerprint Spectrum of Lavender Essential Oil with Partial Least Squares Discriminant Analysis and GC-MS

ZHU Yan, ZHAO Jie, LIU Bing, FU Ji-hong*

(Center for Physical and Chemical Analysis, Xinjiang University, Urumqi 830046, China)

Aim to establish a fingerprint analysis method of essential oil in lavender for quality control by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Twenty-one samples collected in Xinjiang which belong to two different lavender varieties of French blue and C-197(2) are analyzed by GC-MS. Identification of compounds is based on the retention indices and mass library. Twenty-six peaks are selected as the common peaks in fingerprint spectrum. Samples for training set are for pattern recognition by partial least squares discriminant analysis (PLS-DA). Potential biomarkers screening is performed according to VIP value. Through the forecast of 7 unknown samples in the PLS-DA model, the root mean square prediction error of two kinds of lavender essential oil samples is 0.1323, the discrimination accuracy for the lavender varieties is 100% by PLS-DA model based on the validation set of samples. The results show that the established method could be rapid and accurate to evaluate the quality of lavender essential oil.

lavender essential oil；fingerprint spectrum；classification；partial least squares discriminant analysis

2017-03-15 *通讯作者

国家自然科学基金(21565024)；新疆大学博士科研究启动基金(BS120135)

朱燕(1993-)，女，硕士，主要从事天然产物研究；

符继红(1977-)，女，副教授，博士，主要从事天然产物及食品分析研究。

TS225.19

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.09.004

1000-9973(2017)09-0014-05