乔 光，文晓鹏*，丁贵杰

木豆GDSL脂肪酶基因的克隆及表达分析

乔 光1，文晓鹏1*，丁贵杰2

(1.贵州大学农业生物工程研究院，山地植物资源保护与种质创新省部共建教育部重点实验室，贵州贵阳 550025;2.贵州大学贵州省森林资源与环境研究中心，贵州贵阳 550025)

【目的】为探明GDSL家族脂肪酶的抗逆机理，【方法】在前期研究基础上，利用RACE技术克隆木豆GDSL脂肪酶基因，并通过荧光定量PCR技术检测其表达特性。【结果】获得1条木豆GDSL脂肪酶基因，命名为CcGDSL1，该基因含开放阅读框全长1 107 bp，编码369个氨基酸;经同源性分析，CcGDSL1编码的氨基酸序列与豆科植物中GDSL脂肪酶具有较高的相似性。该基因在叶、茎和根中均表达，且叶和茎中表达量显著高于根;干旱胁迫能提高CcGDSL1的表达量，随干旱的持续表现出先降后升随后趋于稳定的表达模式。【结论】推测CcGDSL1基因参与木豆应激干旱胁迫。

木豆;GDSL脂肪酶;克隆;表达

【研究意义】植物脂肪酶根据编码蛋白催化活性区域氨基酸序列的保守型分为GXSXG脂肪酶和GDSL脂肪酶[1]。GDSL型脂肪酶是一类水解酶，广泛存在于原核和真核生物中[2]。随着科学研究的深入发现，GDSL型脂肪酶是一个较大的基因家族，具有器官特异性表达的特点[3]，在生物代谢、发育及形态建成等方面都发挥着重要作用。【前人研究进展】近年来，越来越多的研究发现，GDSL脂肪酶参与了植物逆境胁迫防御过程。Hong等[4]报道辣椒中CaGLIP1同源物受高盐、干旱和伤害等多种胁迫因子的诱导。Naranjo等[5]发现，过表达一个拟南芥GDSL酯酶(AtLTL1)能提高酵母和拟南芥的抗盐能力。可见作为大的植物基因家族，GDSL脂肪酶功能多样，且因物种不同功能也有所差异。木豆(Cajanus cajan)是豆科木豆属唯一栽培种，其植株直立、木质化，为多年生常绿灌木[6]，主要分布在我国云南、贵州、广东、福建和湖南等西南和华南省区[7]。除具有较高的药用和营养价值[8]外，木豆更重要的价值表现在生态保护方面，其耐旱、耐瘠、生长迅速、根系发达，成为南方山地造林、水土保持的优良先锋树种[9]。【本研究切入点】基于木豆抗旱相关基因富集的抑制消减杂交(SSH)文库中1条表达差异显著的EST(NCBI登录号为JK087058)，经序列分析发现其编码的蛋白质与拟南芥GDSL脂肪酶(Q9SVU5.1)同源性较高，目前关于木豆GDSL脂肪酶基因的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】笔者在此基础上开展木豆GDSL脂肪酶基因的克隆及表达分析研究，以期丰富GDSL脂肪酶生物学功能，并为木豆抗旱性研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料及处理

供试木豆品种为桂木1号，播种前先将种子用0.1%升汞消毒5 min，接着用45℃温水浸泡约1 min，无菌水冲洗4次后放置于垫有1张湿润滤纸的培养皿中，转入30℃恒温培养箱中催芽培养1 d。将催芽处理后的种子播种于装有培养基质的塑料盆(15 cm×12 cm)中，每盆播15粒种子，在土壤相对含水量70%～80%、温度20～25℃条件下培养。播种90 d后挑选长势基本一致的幼苗进行干旱胁迫处理，通过称重法控制土壤相对含水量约为田间持水量的50%，对照处理控制在70%～80 %，每处理10次重复(10盆)。分别于胁迫处理后第3、5、10、15、20、25、30天收集植株叶片、茎段和根，液氮速冻后置于-80℃保存备用。

1.2 RNA提取

采用RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司，北京)提取各样品总RNA，使用RNase-free DNase I(天根生化科技有限公司，北京)去除残留基因组DNA。所有操作均参照说明书，提取的RNA于-80℃保存备用。

1.3 全长序列克隆

对已获得的木豆GDSL脂肪酶基因片段进行序列比对分析发现，该片段已具有3'末端的全序列，因此仅需克隆其5'末端序列。利用RACE试剂盒(Clontech，美国)，等量混合对照处理不同时期叶片RNA，以此为模板，利用引物GSP-1(表1)和SUPERSCRIPT IIRT酶(RACE试剂盒提供)进行5' RACE cDNA第1链的合成。以5'RACE cDNA为模板，以GSP-2(表1)和桥连铆钉引物AAP(RACE试剂盒提供)为引物进行第1轮PCR反应;以第1轮PCR反应产物为模板，以GSP-3(表1)和桥连通用扩增引物AUAP(试剂盒提供)为引物，进行第2轮巢式PCR反应，2轮PCR反应条件均参考说明书设置。将第2轮PCR产物回收，克隆到PMD-18T载体(宝生物工程有限公司，大连)上，转化DH5α感受态细胞(天根生化科技有限公司，北京)，挑选阳性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.4 序列生物信息学分析

基因核酸序列的检索及同源性分析由NCBI的BLAST服务器在线完成(http://blast.ncbi.nlm. nih.gov/);基因序列读码框搜索利用在线ORF Finder进行(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi);氨基酸进化树运用Clustal进行多重序列比对，由MEGA 6.0软件生成;氨基酸理化性质预测参照Protparam程序(http://web.expasy.org/protparam/);蛋白质亲水/疏水性分析使用ProtScale在线分析工具(http://expasy.org/tools/protscale.html);磷酸化位点分析和跨膜区分析分别利用丹麦科技大学(DTU)的CBS服务器上的NetPhos 2.0 Server程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/Net-Phos/)和TMHMM Server v.2.0程序(http://www. cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)完成;亚细胞定位通过WoLF PSORT工具完成(http://wolfpsort.seq. cbrc.jp/);蛋白质二级结构预测使用GOR方法完成(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa-automat. pl?page=/NPSA/npsa-hnn.html);蛋白质三级结构预测使用SWISS-MIDEL工具(http://swissmodel. expasy.org)，观察使用Raswin软件。

1.5 基因表达分析

等量混合各处理不同时期根、茎和叶的RNA，以此为模板进行组织特异性表达分析;以各处理不同时期叶片RNA为模板，进行持续干旱胁迫下基因表达分析。参照Quantscript RT Kit(天根生化科技有限公司，北京)操作说明合成cDNA。以RTPF和RTPR(表1)为引物，利用RealMasterMix(SYBR Green)试剂盒(天根生化科技有限公司，北京)在ABI 7500PCR仪上进行荧光定量PCR扩增，3次重复，反应条件为94℃预变性60 s;94℃变性15 s，58℃退火20 s，68℃延伸40 s，40个循环。以ACTF和ACTR(表1)为引物扩增ACTIN基因作为内参，利用2-ΔΔCt计算基因相对表达量。

2 结果与分析

2.1 木豆GDSL脂肪酶基因全长

经过第1轮5'RACE PCR扩增反应后，无特异条带出现。随后进行第2轮巢式PCR扩增，获得约960 bp目的片段，将此目的条带纯化后与pMD18T载体连接、转化后对阳性克隆测序。将测序获得的5'序列与文库中已获得的含3'序列通过中间重叠区拼接，获得该基因cDNA全长序列，共1448 bp，其中开放阅读框(ORF)长度为1107 bp，编码369个氨基酸(图1)，命名为CcGDSL1。

表1 PCR和RACE的引物序列Table 1 Primer sequence of PCR and RACE

2.2 木豆CcGDSL1基因序列的同源性及进化树

2.2.1 同源性 通过对氨基酸序列同源性比对后发现，木豆CcGDSL1与大豆GmGDSL(XP-003542450.1，90%)和野生大豆GsGDSL (KHN05905.1，88%)同源性较高，其次是鹰嘴豆CaGDSL(XP-004495029.2，77%)、首蓿MtGDSL (XP-013468381.1，75%)和菜豆PvGDSL(XP-007162645.1，74%)，而与葡萄VvGDSL(XP-010648948.1，72%)、烟草NtGDSL(XP-009587010. 1，67%)和拟南芥AtGDSL(AEE85543.1，63%)同源性较低(图2)。

图1 木豆CcGDSL1基因核苷酸序列及推测的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of C.cajan CcGDSL1

图2 木豆CcGDSL1与其他植物中GDSL脂肪酶氨基酸序列的同源比对Fig.2 Homologous alignment in amino acid sequence between C.cajan CcGDSL1and GDSL lipase of other plants

2.2.2 进化树 由系统进化树(图3)可得，参与比对的GDSL脂肪酶可以分为3个亚组，其中木豆CcGDSL1与大豆、野生大豆、鹰嘴豆、首蓿和菜豆等豆科植物的GDSL脂肪酶聚为一类，拟南芥与葡萄的GDSL脂肪酶聚为一类，而烟草的GDSL脂肪酶独自分为一类，说明豆科植物GDSL脂肪酶同源性高，进化关系较近，而与拟南芥、葡萄和烟草等植物进化关系较远。

图3 木豆CcGDSL1与其他植物中GDSL脂肪酶的系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree of C.cajan CcGDSL1 and GDSL lipase of other plants

2.3 木豆CcGDSL1基因的生物信息学序列

图4 木豆CcGDSL1的三维结构Fig.4 Three dimensional structure of C.cajan CcGDSL1

理化性质预测结果表明，木豆CcGDSL1分子量为40.44 kDa，理论等电点(PI)为8.88，含量较丰富的是缬氨酸(V)8.1%、甘氨酸(G)8.9%、亮氨酸(L)9.8%，带负电荷的氨基酸残基总数为22个，带正电荷的氨基酸残基总数为28个，其消光系数为23880，蛋白质不稳定指数为35.16，该蛋白质属于稳定蛋白质，脂肪族指数86.37;根据ProtScale Sever在线分析，木豆CcGDSL1为疏水蛋白;根据磷酸化位点分析和跨膜区分析，该脂肪酶属跨膜蛋白，含8个色氨酸(Ser)、6个苏氨酸(Thr)和6个酪氨酸(Tyr)，可能成为蛋白激酶磷酸化位点;亚细胞定位预测得分为液泡6.0分，叶绿体3.0分，细胞外3.0分，细胞核1.0分，表明该蛋白最大可能定位于液泡;使用GOR方法进行蛋白质二级结构预测，表明木豆CcGDSL1由37.13%的α-螺旋、14.36%的延伸链和48.51%的无规则卷曲构成;用SWISSMODEL数据库预测该蛋白三维结构，包括12个α-螺旋，11个β-折叠和38个β-转角(图4)。

图5 木豆CcGDSL1基因在不同组织(A)和叶中不同干旱处理时间(B)的表达量Fig.5 Expression quantity of C.cajan CcGDSL1 in different tissues(A)and leaf under different drought treatment days(B)

2.4 木豆CcGDSL1基因的时空表达

利用荧光定量PCR检测木豆CcGDSL1基因的组织表达差异发现，该基因在木豆幼苗叶、茎和根中均表达，其中叶和茎中表达量差异较小，显著高于根中表达量(图5A)，说明木豆CcGDSL1基因表达具有组织特异性。以干旱和对照2个处理叶片cDNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，检测木豆CcGDSL1基因持续干旱条件下表达情况，随着处理时间的增加，干旱和对照处理木豆CcGDSL1基因表达量均呈先降后升的趋势，在处理5～15 d时，表达量降到最低，随后表达量上升，在25～30 d时表达量趋于稳定，并且在整个处理时间内，干旱胁迫下其表达量均高于对照处理(图5B)。

3 讨 论

GDSL脂肪酶是广泛存在于植物界的一个多基因家族，具有水解酶活性，能水解多种脂类物质[10]。近年来，人们从拟南芥、水稻、玉米、葡萄和杨树等多种植物中发现的GDSL脂肪酶成员超过1100个，其中在拟南芥中共发现108个家族成员，葡萄中发现96个家族成员[11-12]。本研究在前期构建的木豆干旱胁迫SSH文库基础上，克隆获得了1个木豆CcGDSL1基因的全长序列，丰富了植物GDSL脂肪酶家族成员。植物GDSL脂肪酶蛋白质的一级结构包括5个保守区域(I～V)，在酶催化过程中起重要作用的氨基酸残基Ser(S)、Gly(G)、Asn(N)和His (H)分别位于I、II、III和V4个保守域中[13]。由氨基酸序列同源性分析发现，木豆CcGDSL1脂肪酶氨基酸序列与其他植物存在差异，但在这4个保守域中未发生变异。系统进化树分析表明，GDSL酯酶在豆科植物进化中具有较高保守性。

Oh等[14]对1个含有GDSL结构域的分泌蛋白(GLIP1)进行亚细胞定位发现，GLIP1定位于胞外基质。奈婕菲等[15]构建了GFP融合表达载体，将1个杨树GDSL蛋白定位于细胞壁。Ling等[12]利用亚细胞定位分析工具将99个拟南芥GDSL脂肪酶蛋白定位于内质网。还有研究报道将含有GDSL结构域的蛋白定位于细胞内膜和囊泡等[16]，本研究利用WoLF PSORT预测工具将CcGDSL1蛋白定位于液泡，这些蛋白在细胞亚结构的不同定位，显示着不同GDSL具有的多种生物学功能[2]。

植物GDSL脂肪酶家族成员组织表达模式存在冗余性和特异性[15]，Lee等[17]研究发现，拟南芥与抗病相关的GDSL脂肪酶基因(AtGLP1)在幼苗、叶、根、茎和花中均有表达，而与之高度同源的AtGLP2却仅在幼苗、茎和根中表达。奈婕菲等[15]发现，杨树GDSL基因在不同茎节上转录表达丰度不同。本研究发现，木豆CcGDSL1基因在叶和茎中表达量接近，显著高于根中表达量。

植物GDSL脂肪酶广泛参与植物正常生长发育、器官形态建成和次生代谢等生理活动。近年来，越来越多文献报道其参与逆境胁迫生理过程。Kram等[18]研究发现，蓝花楹花蜜中的GDSL脂肪酶JNP1可以直接破坏微生物的细胞膜而抑制微生物活性，从而参与植物的抗逆反应。Kwon等[19]研究证明，拟南芥GLIP1蛋白能够响应乙烯信号而激发系统抗性。本研究发现，木豆CcGDSL1基因在干旱胁迫下表达量升高，说明其有可能参与到木豆抗旱的生理过程。同时，干旱与对照处理随着木豆幼苗的生长CcGDSL1基因均表现出先下降后上升的趋势，说明该基因也参与到木豆生长发育过程，其原因可能是脂肪酶是脂代谢中的关键酶，能催化长链脂肪酸甘油酯水解为甘油和长链脂肪酸，而脂肪酸是生物体中重要的组成成分，可作为重要的信号分子参与细胞的生长发育[20]。由此可见，木豆CcGDSL1基因具有复杂功能，要想全面阐明该基因的功能还有待于进一步研究。

4 结 论

克隆获得了木豆CcGDSL1基因序列，其ORF全长1107 bp，编码369个氨基酸。生物信息学分析结果表明CcGDSL1脂肪酶为稳定的疏水蛋白，有20个磷酸化位点，定位于液泡，属跨膜蛋白，与豆科植物GDSL脂肪酶同源性较高、进化关系较近。该基因具有组织表达特异性，在叶和茎的表达量显著高于根中表达量，且干旱胁迫能诱导其大量表达，说明木豆CcGDSL1参与抗旱生理过程，其生理功能丰富。

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(责任编辑 刘忠丽)

Cloning and Expression Analysis of GDSL Lipase Gene in Cajanus cajan

QIAO Guang1，WEN Xiao-peng1*，DING Gui-jie2
(1.Key Laboratory of Plant Resource Conservation and Germplasm Innovation in Mountainous Region Ministry of Education，Institute of Agro-bioengineering，Guizhou University，Guizhou Guiyang 550025，China;2.Research Center for Forestry Resources and Environment，Guizhou University，Guizhou Guiyang 550025，China)

【Objective】The aim of the present paper is to discuss the adverse stress resistancemechanism of GDSL lipases.【Method】The GDSL lipase of C.cajan is cloned by RACE technology based on the preliminary study and then the expression characteristics are detected by fluorogenic quantitative PCR.【Result】An obtained GDSL lipase of C.cajan is named as CcGDSL1 and its total length of open reading frame is 1107 bp with 369 amino acids.The homology analysis shows that the amino acid sequence of CcGDSL1 has a high similarity with GDSL lipases of other legume plants.CcGDSL1 can express in leaf，stem and rootbut the expression quantity in leaf and stem is higher than in root significantly.Drought stress can increase the expression quantity of CcGDSL1 and the expression quantity of CcGDSL1 presents an expression pattern of first declining，then rising and finally stable with sustained drought.【Conclusion】CcGDSL1 may participate in stress reaction of C.cajan under drought stress.

Cajanus cajan;GDSL lipase;Cloning;Expression

S643.9

A

1001-4829(2017)8-1720-06

10.16213/j.cnki.scjas.2017.8.005

2016-12-17

国家自然科学基金项目“利用GeneFishing解析VA菌根增强木豆抗旱能力的分子机理”(30860224);贵州省科学技术基金项目“在转录水平解析木豆抗旱的分子机理”(20092076)

乔 光(1981-)，男，山西晋中人，博士，从事森林培育研究，E-mail:13518504594@163.com，*为通讯作者:文晓鹏，E-mail:xpwensc@hotmail.com。