余桂容，张 维，杜文平，宋 军，陈 谦，徐利远*

抗草甘膦转基因玉米外源基因ddPCR拷贝数分析

余桂容1，张 维2，杜文平1，宋 军1，陈 谦1，徐利远1*

(1.四川省农业科学院生物技术核技术研究所，四川成都 610066;2中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081)

【目的】本研究是从前期获得的100余份转基因抗除草剂草甘腾玉米品系中，挑选T抗-1等14个转基因玉米品系进行拷贝数检测。【方法】采用一种新型的拷贝数分析方法——微滴数字PCR技术(droplet digital PCR，简称ddPCR)，设计特异引物对外源抗草甘腾基因2mG2-epsps进行绝对定量分析。【结果】供试的14份转基因材料中10份是单拷贝品系。同时，通过引物探针特异性试验、叶片基因组DNA的PCR抑制和浓度检测、转基因玉米的外源基因2mG2-epsps的实时PCR检测和基因组DNA的酶切等系列研究，建立稳定的转基因玉米拷贝数分析的ddPCR检测体系。【结论】微滴数字PCR技术为这批转基因玉米的下一步转基因生物安全评价提供了重要参数，同时建立了转基因玉米(geneticallymodified maize)外源基因拷贝数ddPCR分析方法。

转基因玉米;草甘腾抗性;外源基因;拷贝数;微滴数字PCR(ddPCR)

【研究意义】自1996年转基因农作物商业化种植20多年以来，全球转基因农作物种植面积迅猛发展，随着转基因技术的广泛应用，如何准确、精确地确定转基因生物的外源基因拷贝数，已经成为现今转基因产品检测技术研究的一个关键点[1]。无论国际还是国内在转基因生物安全管理和安全评价过程中，外源基因拷贝数都是生物安全评价的重要评价参数。因为外源基因整合进入作物受体基因组的方式(插入位点、拷贝数和旁侧序列等)会影响目的基因和功能蛋白的表达以及外源基因在受体中的遗传稳定性，特别是整合的拷贝数多少影响尤为重要[2]。目前，大多数转基因方法都是随机整合进入受体基因组，而且大多数是以多拷贝的方式整合到受体基因组上。通常当外源基因以1～2个低拷贝数整合到受体基因组时可以高效的表达，而多拷贝数的整合会造成不稳定表达，甚至基因沉默[3]。因此，探明转基因材料的外源基因拷贝数对于下一步的育种应用显得尤为重要。【前人研究进展】微滴数字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)是近年来兴起的一种新的绝对定量技术，通过极度稀释实现理论上的单分子扩增，然后用终点法PCR和泊松分布计算出样品的原始浓度[4]。将含有模板、引物/荧光探针、耐热DNA复制酶及其缓冲液的荧光PCR反应体系充分混匀之后等量均分为相互隔离的(大于10000个)油包水微滴，使每个模板独立随机地分配至微滴中;所有微滴同时在相同的规定条件下进行PCR扩增反应之后，根据设定的荧光阈值判断每个微反应体系的扩增结果;依据微滴的阳性率和泊松分布公式计算得到ddPCR反应体系中的模板浓度。依据样品DNA溶液中的外源基因序列(exogenousgene sequence)和玉米特异性基因(Species specific gene)的模板浓度之比，得到样品中外源基因拷贝数。姜羽[5]等利用ddPCR分析转基因生物外源基因拷贝数表明，微滴数字PCR方法是一种经济、快速和准确的外源基因拷贝数分析新方法，灵敏度和准确性高，将会在拷贝数分析中广泛应用。潘广[6]等应用双重数字PCR对转基因玉米成分进行定量方法研究，建立了转基因玉米T25双重数字微滴式PCR定量方法。姜志军[7]等以微滴数字PCR技术简便快速的完成外源草甘膦抗性基因G23VEPSPS拷贝数的分析。同时，微滴数字PCR方法也在食品成分分析、临床诊断、基因表达分析[8]、微生物检测[9]、新一代测序验证[10]等领域具有巨大优势和应用潜力。苗丽[11-12]等利用微滴数字PCR分析肉制品中猪源性、牛源性、羊源性成分分析，检测显示该方法能够准确检测出不同样品中不同肉源的含量。耿娟[13]等利用数字PCR进行产前诊断，可在介入性产前诊断及无创产前基因诊断胎儿非整倍体疾病和单基因疾病方面具有重要作用。【本研究切入点】ddPCR平台已经用于测量转基因产品成分的定量分析等[14]，但基于ddPCR平台的转基因生物外源基因拷贝数的分析工作报道较少。本研究基于ddPCR平台，建立了转基因玉米外源基因拷贝数分析方法。【拟解决的关键问题】研究结果为为这批转基因玉米的下一步转基因生物安全评价提供了重要参数，为这批材料的进一步培育转基因新品种奠定基础，也为分析其他转基因玉米品系外源基因拷贝数提供了新的方法和借鉴。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究以转基因抗除草剂草甘膦玉米T抗-1等14个品系为研究对象，一个非转基因玉米品系为阴性对照，共15份材料，样品性质为玉米叶片。

样品来源:四川省农业科学院生物技术核技术研究所2016年春季大田种植121份转基因抗除草剂草甘膦玉米品系，经抗性筛选结合田间农艺性状的综合表现，挑选14个转基因玉米品系进行拷贝数检测，样品编号见表1，外源基因都为2mG2-epsps，且使用同一载体。

抗除草剂草甘膦基因2mG2-epsps来源:中国农业科学院生物技术研究所林敏研究员课题组。

1.2 试剂与设备

ddPCRTMSupermix for probes，Droplet Generation Oil for Probes为美国BIO-RAD公司产品;内切酶为大连宝生物公司产品。其他常用试剂均是国产试剂;引物和探针由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。

Bio-Rad QX200 ddPCR微滴生成仪和读数仪(美国Bio-Rad公司);7500 Real-Time PCR仪美国AB公司。高速离心机(美国Thermo公司);电子天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司);紫外分光光度计(德国Eppendorf公司)。

1.3 测试方法

1.3.1 叶片基因组DNA提取 DNA提取采用Murray和Thompson等的CTAB法，略做修改。

1.3.2 引物与探针的设计 根据插入基因序列信息，为了使扩增片段能代表完整可表达的2mG2-epsps基因，将引物探针设置在2mG2-epsps基因和前导肽的结合区，进行同源序列比对，运用Primer Express 5.0软件设计数字PCR引物和探针。引物和探针序列见表2。

为了使扩增片段能代表可完整可表达的2mG2-epsps基因，将引物探针设置在2mG2-epsps基因和前导肽的结合区。

玉米内参基因引物和探针:根据文献，玉米Hmg基因为单拷贝基因，其引物和探针位置如下所示:

表1 玉米叶片样品编号Table 1 The number of corn leaf sample

表2 引物和探针序列Table 2 Primer and probe sequences for ddPCR assays

1.3.3 转基因玉米的外源基因实时PCR检测 实时荧光PCR反应体系为25μl:ABI Taq man PCR mastermix 12.5μl，上、下游引物各1μl(10μmol)，探针1μl(10μmol)，DNA模板(10～100 ng/μl)5 μl，灭菌双蒸水补足体系。反应循环参数为:50℃/ 2 min;95℃/10 min;95℃/15s，60℃/1 min，40个循环。

1.3.4 基因组DNA的酶切 经对外源基因的分析，选择Sal I对基因组进行酶切，Sal I的酶切位点为:G/TCGAC。

酶切体系:Sal I(takara)1μl，10×Buffer 2μl，DNA 5μl，ddH2O 12μl，酶切条件:37℃60 min，95℃10 min。

1.3.5 Hmg基因和2mG2-epsps基因浓度的ddPCR检测 采用玉米Hmg基因和转基因2mG2-epsps的引物探针分别扩增玉米14个样品酶切后DNA。

微滴式数字PCR反应体系为:ddPCRTMSupermix for Probes 10μl，上、下游引物各1μl(10μmol/ L)，探针1μl(10μmol/L)，DNA模板(10～100 ng/ μl)5μl，加双蒸水补足总体积至20μl。

将生成的微滴全部转入96孔荧光PCR反应板中，进行PCR扩增。荧光PCR包括3个步骤:95℃预变性10 min;94℃变性30 s，60℃退火1 min，50个循环;98℃固化微滴10 min。最后用微滴分析仪对扩增产物进行计数分析。

2 结果与分析

2.1 引物探针特异性实验

采用转基因玉米2mG2-epsps基因的引物/探针对阴性对照和14个样品的DNA进行实时PCR扩增。阴性对照和阳性样品的扩增结果显示，2mG2-epsps基因的引物探针特异性良好，除阳性样品外，空白和阴性样品均没有出现扩增(图1)。以上结果说明表2中的引物和探针均能有效扩增靶基因。这些引物和探针可以用于后续的微滴式数字PCR定量检测实验。

2.2 叶片基因组DNA的PCR抑制和浓度检测

采用玉米内参Hmg基因的ZM1引物/探针对阴性对照和14份样品的DNA进行实时PCR扩增。扩增结果表明，所有样品DNA溶液没有明显扩增抑制，浓度和纯度适于后续ddPCR检测(图2)。

2.3 转基因玉米的外源基因2mG2-epsps的实时PCR检测

为了确定样品中转基因玉米2mG2-epsps基因的存在，采用2mG2-epsps基因的特异性引物/探针对14个样品的DNA进行实时PCR扩增。扩增结果显示，样品中存在靶基因，需进行后续ddPCR测试(图3，表3)。

图1 2mG2-epsps基因的引物探针特异性试验Fig.1 Specific test of2mG2-epsps primer probe

图2 玉米内参Hmg基因的实时PCR扩增结果Fig.2 Real-time PCR amplification of HMG gene in maize

图3 转基因玉米2mG2-epsps基因的实时PCR扩增结果Fig.3 Real-timePCRamplificationof2mG2-epspsgeneintransgenic maize

2.4 基因组DNA的酶切

转基因玉米样品中外源基因可能存在串连重复现象，如不进行酶切，可能将串连重复片段视为单个拷贝。为避免此问题，对转基因玉米样品DNA进行酶切消化。从图4可见，玉米样品DNA已消化完全，原液中的线粒体片段已消失不见。酶切溶液可用于后续ddPCR测试。

图4 转基因玉米样品T抗-1的DNA的酶切电泳图谱Fig.4 TheDNAenzymedigestionelectrophoresisofgeneticallymodifiedcornsamplesTkang-1

表3 玉米叶片样品DNA的2mG2-epsps基因的实时PCR扩增Ct值Table3 Real-timePCRamplificationof2mG2-epspsgeneofDNAinleafsampleofmaize

表4 转基因玉米DNA的Hmg/2mG2-epsps基因拷贝数的ddPCR检测值单位(copies/μl)Table4 ThecopynumberofthegeneticallymodifiedmaizeHmgand2mG2-epspsgenebyddPCRunit(copies/μl)

表5 转基因玉米DNA的Hmg/2mG2-epsps基因拷贝数比值Table5 TheratioofthecopynumberingeneticallymodifiedmaizeHmgand2mG2-epspsgene

图5 玉米不同品系1Hmg基因和2mG2-epsps基因的ddPCR热点图(2mG2-epsps基因(左图)和Hmg基因(右图)的ddPCR热点图)Fig.5 The ddPCR heap map of1 Hmg gene and 2mG2-epsps gene in differentmaize lines The ddPCR heapmap of2mG2-epsps gene(left)and Hmg gene(right)

2.5 玉米样品Hmg基因和2mG2-epsps基因拷贝数的ddPCR检测

由表4转基因玉米DNA的Hmg/2mG2-epsps基因拷贝数的ddPCR检测值和表5基因拷贝数比值可见样品重复度非常好，14个样品中有10个是单拷贝。

采用QX200 ddPCR微滴生成仪和读数仪(美国Bio-Rad公司)及玉米Hmg基因和2mG2-epsps基因引物探针，对14个转基因阳性玉米样品中Hmg/ 2mG2-epsps基因拷贝数进行检测。微滴荧光检测仪的检测结果见ddPCR热点图(图5)。

所有反应的拷贝数在合理范围内(100～4000 copies/μl)，2次重复实验的结果相近，实验重复性良好。从热点图中可分析，每个反应的阴性微滴和阳性微滴的荧光值区分明显。实验检测的数据质量良好。

3 讨 论

研究外源基因在受体基因组上的拷贝数的方法有多种，得到公认的经典方法是传统的qRT-PCR、Southern blot，这2种方法已经较成熟应用于转基因生物外源基因拷贝数的分析中，但这2种方法也存在一定缺陷。例如，Southern-blot方法分析时工作量大、周期长、操作要求高、准确性较差，特别是对于多拷贝基因的分析，结果容易偏小[15];qRT-PCR在分析外源基因拷贝数时必须依赖于标准曲线和已知拷贝数的基因，只是一种相对定量方法，且标准曲线的质量易受到DNA纯度、引物和探针的浓度、反应抑制因子等诸多因素影响[16]。相对来说，本研究采用的ddPCR定量分析方法在特异性、灵敏度和重复性上面都优于前两者，而且受DNA纯度影响小，受引物间相互干扰小，与扩增效率无关，更节约时间、精力和实验药品，是一个新兴崛起的分析方法。

另外，本研究参考前人的研究，采用转基因玉米T抗-1等叶片基因组DNA为模板，而不是用种子的基因组DNA，消除了因种子胚乳3倍体带来的转基因质量百分比含量和计算含量的误差，从而得以保证分析和比较ddPCR定量方法的准确性[5]。

在拷贝数分析应用方面，拷贝数研究需要极高的定量精度，以区别不同拷贝数之间的微小差异，而ddPCR具有高精确度的特点，通过精确计定量目标基因与参照基因(拷贝数为1的基因)，并计算它们的比值，从而得到目标基因的拷贝数，对不同拷贝数的分辨精度远高于qPCR和测序[17]。

ddPCR是一个拥有巨大潜力的新兴技术，由于其独特的技术优势和应用前景，近几年来其产业化发展相当迅速，应用也越来越得到重视。可以预见，在未来几年内，ddPCR技术将会进一步发展与完善，应用范围也会大大扩展，有望从一种小众技术发展成为实验室中的标准工具。

4 结 论

本研究通过引物探针特异性试验、叶片基因组DNA的PCR抑制和浓度检测、转基因玉米的外源基因2mG2-epsps的实时PCR检测和基因组DNA的酶切等系列研究，建立稳定的ddPCR体系，分析了转基因玉米T抗-1等的2mG2-epsps基因，结果表明，所有供试的14个样品中都检出2mG2-epsps基因片段，其中10个样品(T抗-1、2号、5号、6号、74号、81号、85号、86号、106号、114号)中2mG2-epsps基因和玉米内源Hmg基因拷贝数相同，是单拷贝材料;另外4个样品(80号、102号、109号、118号)中玉米内源Hmg基因拷贝数是2mG2-epsps基因的2倍，为非纯合体。

本文在国内首次建立了转基因玉米品系T抗-1等微滴式数字PCR定量方法。而且多次重复研究显示本研究所建立的玉米品系T抗-1等数字ddPCR定量方法特异性强、灵敏度高、结果重复性好，不依赖任何外部标准、能够有效节省试剂和样品，是一种精确、灵敏的转基因生物外源基因拷贝数分析新方法。

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(责任编辑 李 洁)

Estimation of Exogenous Genes Copy Number of Genetically M odified Glyphosate-Resistant M aize by Droplet Digital PCR

YU Gui-rong1，ZHANGWei2，DUWen-ping1，SONG Jun1，CHEN Qian1，XU Li-yuan1*
(1.Institute of Biotechnology and Nuclear Techniques，Sichuan Academy of Agricultural Sciences，Sichuan Chengdu 610066，China;2. Biotechnology Research Institute，China Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China)

【Objective】The exogenousgene copy number of Tkang-1 etc.14 wasestimated geneticallymodifiedmaize based on the early stage of the geneticallymodifiedmore than 100maize(Zeamays L.)materialswith higher resistance and better comprehensive agronomic characters，in order to pass through the transgenic biosafety evaluation and fit in with the needsof breeding new transgenicmaize varieties.【Method】A new kind of analysismethod was adopted for the exogenous gene copy number——the droplet digital PCR technology(droplet digital PCR，ddPCR).And specific primer of exogenousgene2mG2-epsps was designed to analyze the copy number by absolutely quantitativemethod.【Result】The analysis showed that10 of14 transgenicmaterialswere single copies.At the same time，a stable test system was established for analyzing the exogenous gene copy number of geneticallymodified maize by the studying of designing specific primer of exogenous gene 2mG2-epsps，testing the PCR inhibitor and concentration of leafgenome，real time PCR-testing for the exogenous gene of the transgenicmaize，restricting genome DNA and so on.【Conclusion】This paper provided important parameters for the further transgenic biosafety evaluation of transgenicmaize，laid a strong foundation for breeding new transgenicmaize varieties and established the genetic copy number analysismethod of geneticallymodified maize.

Geneticallymodified maize;Glyphosate resistance;Exogenous gene;Copy number;Droplet digital PCR(ddPCR)

S513

A

1001-4829(2017)8-1707-06

10.16213/j.cnki.scjas.2017.8.003

2017-02-24

四川省农科院高新技术研究应用专项(2016GXTZ-001)，转基因生物新品种培育重大专项(2014ZX0800301B);四川省农科院财政基因工程项目(2016ZYPZ-003)

余桂容(1971-)，女，四川荣县人，副研究员，主要从事玉米基因工程育种，*为通讯作者:徐利远，研究员，主要从事农作物遗传育种研究，E-mail:yuguirong@163.com。