黄 珊， 赖仁发， 钟丽珍

(暨南大学附属第一医院口腔科，广东 广州 510632)

幽门螺杆菌感染对人牙龈组织细胞凋亡的影响

黄 珊， 赖仁发△， 钟丽珍

(暨南大学附属第一医院口腔科，广东 广州 510632)

目的： 观察正常牙龈组织中幽门螺杆菌(Hp)的感染情况及其对人牙龈组织细胞凋亡的影响。方法: 采用聚合酶链式反应(PCR)检测30例健康牙龈组织中Hp感染情况，应用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的原位缺口末端标记(TUNEL)法检测牙龈组织中的细胞凋亡指数，分析Hp对牙龈组织的毒性作用。结果: PCR检测的30名患者，Hp阳性率为40%。在TUNEL结果中，可见Hp阳性组有大量棕色凋亡细胞，部分细胞核固缩成团或核膜周围边集成环状。而正常对照组中阳性凋亡细胞较Hp感染组明显偏低，2组细胞凋亡指数差异有统计学意义。结论: Hp感染可能是引起牙龈组织细胞凋亡的因素之一。

牙龈组织； 幽门螺杆菌； 细胞凋亡

牙周炎是发生于牙周支持组织的慢性炎症性疾病，可导致口腔异味、牙松动移位、甚至牙脱落等并发症状，严重影响患者的生活质量。现代医学认为牙菌斑是引发该疾病的始动因子，通过毒力因子或介导不同介质引起牙周组织细胞凋亡、坏死等形态与性质的异常。由于口腔与胃肠道同属消化系统，其黏膜性状多有相似之处，而幽门螺杆菌(Helicobacterpylori，Hp)是胃肠道的重要致病菌，近些年在口腔牙周袋内也多次分离检测到。因此，不少文献推测口腔幽门螺杆菌与牙周组织致病相关。Sudhakar等[1]研究显示口腔卫生差的患者，牙菌斑内Hp的阳性率显著增高。2010年，Song等[2]检测42名消化系统不适的患者口腔多部位Hp，发现牙菌斑中Hp 阳性率可达97%。然而，由于口腔Hp相对浓度较低，仅在龈沟液、唾液或牙菌斑中取样检测有一定难度，且随着取样位点的不同，其阳性率也多有不同。因此，常有与以上研究矛盾的结果出现。甚至有学者认为，幽门螺杆菌是口腔的正常菌群之一，并无治疗的意义[3]。幽门螺杆菌的口腔致病性还在争议中。本实验通过比较Hp感染情况及Hp阳性与阴性两组牙龈组织的细胞凋亡指数，推测Hp的存在是否对牙周组织产生影响。

材 料 和 方 法

1 仪器与试剂

脱水机(武汉俊杰电子有限公司)；包埋机(武汉俊杰电子有限公司)；病理切片机(上海徕卡仪器有限公司)；冻台(武汉俊杰电子有限公司)；组织摊片机(浙江省金华市科迪仪器设备有限公司)；烤箱(上海福玛实验仪器有限公司)；水浴锅(天力医疗器械有限公司)；脱色摇床(北京市六一仪器厂)；涡旋混合器(天悦电子)；倒置荧光显微镜和成像系统(Nikon)；ABI9700 PCR扩增仪(ABI)；TUNEL试剂盒(Roche)

其它：无水乙醇、二甲苯、PBS缓冲液、破膜液、双氧水、甲醇、苏木素染液、盐酸、氨水、中性树胶、DAB显色剂等均为国产产品。

2 标本来源

选择2016年9月～2017年2月暨南大学附属第一医院口腔科因牙折须行冠延长手术的患者30例，男12例，女18例，年龄25～40岁。纳入标准:(1)牙周探诊深度<3 mm，无附着丧失和明显炎症存在；(2)X线片示无牙槽骨吸收。排除标准:3个月内服用抗生素及铋剂或质子泵抑制剂等胃药者及患有其它全身性系统疾病者。

进行冠延长的患者局麻下切除颈圈2 mm以上牙龈组织送检。每个样本切断成2份。1份直接放入高温消毒过的无菌Eppendorf管中，-70 ℃冰箱保存备用，进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)；1份经中性甲醛液常温下固定，用于TUNEL检测。

3 实验方法

3.1 PCR技术检测牙龈组织Hp (1)DNA 提取：将实验样品和10 μL PK Solution、200 μL Lysis Buffer于离心管混合，振荡5～10 s；56 ℃温浴10 min；加入200 μL无水乙醇，充分振荡混匀5～10 s；将混匀的液体转移至一只套有收集管的Spin column上。8 000×g离心1 min，弃去套管内的液体；加入500 μL WB Buffer，10 000×g离心60秒；加入700 μL Wash Buffer上，10 000×g离心60 s，弃废液；再将Spin column放回接液管上，13 000×g离心2 min；将Spin column转移到一只干净的1.5 mL离心管，向离心柱内加100 μL Elution Buffer，静置1 min，13 000×g离心1 min，离心管内液体即为基因组DNA，-20 ℃保存。(2)PCR检测：在0.2 mL PCR反应管中配制PCR反应体系(引物序列：27F: 5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’，1492R:5’-TACGYTACCTTGTTACGACTT-3’，由上海生工生物技术有限公司合成)；取PCR扩增产物进行1% 琼脂糖凝胶电泳，120 V电压电泳25 min；高分辨率质谱分析仪下观察，若在300 bp处出现荧光条带，可诊断Hp阳性。

3.2 TUNEL技术检测凋亡细胞 石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15 min-二甲苯Ⅱ15 min-无水乙醇Ⅰ5 min-无水乙醇Ⅱ5 min-85%乙醇5 min-75%乙醇5 min-蒸馏水洗。切片组织修复：滴加蛋白酶K工作液(蛋白酶K储存液用PBS 1∶9稀释)，37 ℃温箱中放置30 min，将玻片置于PBS (pH 7.4)中晃动洗涤3次，每次5 min。滴加破膜工作液，常温20 min，玻片置于PBS中清洗。按片子数量和组织大小取TUNEL试剂盒内适量试剂覆盖组织，切片平放于湿盒内，37 ℃恒温孵育2 h。清洗TUNEL试剂后，用甲醇配制的3%过氧化氢溶液室温避光孵育组织15 min，切片稍甩干后，加适量试剂3(converter-POD)覆盖组织，切片平放于湿盒内，37 ℃温箱中孵育30 min。将玻片晃动洗涤3次，每次5 min。切片稍甩干后滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间，自来水冲洗切片终止显色。Harris苏木素复染3 min左右，自来水洗，1%的盐酸乙醇分化数秒，自来水冲洗，氨水返蓝，流水冲洗。切片脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。

结果判断：苏木素染细胞核为蓝色，DAB显色出来的阳性凋亡细胞核为棕黄色。采用双盲观察计数, 每张切片随机选取3个阳性染色最明显的高倍视野(×400),计数300个以上细胞中凋亡阳性细胞所占百分率, 取其平均值，即为凋亡指数(apoptotic index， AI)。

4 统计学处理

用SPSS 19.0统计软件对结果进行分析，数据采用均数±标准差(mean±SD)表示，均数比较采用两独立样本的t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 PCR技术检测牙龈组织Hp感染

本次研究采用PCR技术检测牙龈组织，共送检30例样本，其中12例可呈现荧光条带，即Hp检测结果呈阳性感染，另外18例则为Hp阴性，阳性率为40%，见图1。该结果与以往国内外对正常牙周组织Hp阳性率的测试结果无明显差异，可进行下一步分析。

2 Hp感染组和正常对照组牙龈组织中的细胞凋亡指数

将送检样本按Hp感染与否分为2组，经两独立样本均数比较的t检验(经方差齐性检验, 各组间总体方差齐性相同)，Hp感染组牙龈组织中细胞凋亡指数明显高于正常对照组(P<0.05)，见表1。凋亡阳性细胞核呈棕褐色, 轮廓清楚, 在Hp感染组牙龈组织中见多量凋亡细胞，而正常对照组牙龈组织中凋亡细胞相对较少，见图2。

Figure 1.The fluorescent bands of Hp (+) detected by PCR.

图1 Hp感染PCR荧光带

表1 Hp感染组和阴性对照组牙龈组织中细胞凋亡指数的比较

Table 1.Comparison of apoptotic index (AI) in Hp positive group and Hp negative group (mean±SD)

GroupnAIHp(+)120.498±0.092Hp(-)180.207±0.053*

*P<0.05vsHp(+) group.

Figure 2.TUNEL staining in gingival tissues (×200).

图2 牙龈组织细胞凋亡图

讨 论

1 Hp与牙周炎

口腔中的Hp是“过路菌”还是可长期在口腔定植? 它是口腔疾病的致病菌，还是口腔中的正常菌群? 这些相关性问题一直存在争议。大多数研究认为，Hp可能是一种条件致病菌，当口腔环境发生改变时，Hp可在其中定植，并引起各种相关性疾病。Everhart等[3]对血清Hp抗体的流行病学进行调查，发现血清Hp与牙周病相关参数之间呈正相关，牙周袋内牙菌斑为Hp的生存提供有利的为微需氧环境。在波兰，Bielahski 等[4]通过大样本量的调查发现胃Hp感染率与牙周病发病率密切相关。

PCR技术作为一种分子生物学工具，其阳性误诊率低，用于牙菌斑、唾液的检测，可以选择性体外扩增，不受标本菌量条件的影响。近年来发展起来的实时荧光定量PCR实现了从定性到定量的飞跃，更在敏感性上得到较大提高，降低漏检率。荧光定量PCR利用对DNA的高效扩增，在反应体系中加入荧光基团，通过荧光信号的累积实时反映整个检测进程，最后根据标准曲线对标记物浓度进行定量分析，除此以外，相比传统的PCR技术，荧光定量PCR操作简单、特异性强、污染小。它已广泛应用于多种微生物感染的检测，国内外亦有用该方法检测Hp的报道。Silva等[5]采用PCR方法检测115例受试者的口腔中的Hp，根据有无胃肠道疾病和牙周疾病分为4 组，证明疾病组的Hp阳性率显著高于其它组，说明Hp阳性者更易发生牙周炎，并认为在治疗Hp相关胃肠道疾病的同时须重视清除牙菌斑。Suzuki等[6]通过PCR技术对326例无消化不良症状患者进行Hp检测，发现Hp感染可能间接与牙周病导致的口臭有关。高静等[7]用PCR方法检测37例牙周炎患者口腔菌斑和含漱液中的Hp，结果显示：尿素酶C基因和CagA基因阳性率在牙周炎组明显高于健康组，该实验亦支持Hp参与或加强了慢性牙周炎的致病过程。

然而，也有不少学者认为，Hp只是过路菌，并不在口腔中长期定植，其存在可能是偶居的结果。Namiot等[8]发现胃Hp患者天然牙菌斑的Hp检出率为89%，但与口腔卫生或牙菌斑的控制均无明显关联。Mravak-Stipetif 等[9]也得出了类似的结论。他们通过PCR技术对各种口腔病变组织中的Hp进行了检测。他们从口腔内7个不同的部位抽取标本，发现161例病人中仅有21例(13.04%)为阳性，并且Hp的存在与否及状态与诊断结果间也没有必然的联系。在以上反对者的研究里，口腔环境中既没有发现Hp聚集的优势区，也没有发现细菌的存在与疾病间的必然联系。

随着逐步深入的幽门螺杆菌致病性研究，人们发现每种 Hp所表达和分泌的毒性因子都有其特殊的致病机制。Hp感染口腔后，其毒力因子是否对牙周组织具有致病作用，尚未得到证实。

2 牙周炎与细胞凋亡

细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同，它并不是病理条件下的自体损伤，而是为更好地适应生存环境而主动死亡，是一种进化保护的过程[10]。研究发现，细胞凋亡是由一类天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate-specific protease，caspase)家族参与进行[11-12]。该蛋白酶分别通过外在途径(死亡受体凋亡途径)和内在途径(线粒体凋亡途径)介导细胞凋亡。细胞凋亡发生时，细胞与周围细胞群脱离，表面原有的微绒毛、细胞间连接消失，核糖体逐渐从粗面内质网上脱离，内质网囊腔扩胀，其DNA被特征性降解为片段。在电镜下观察，细胞凋亡的细胞可发生一系列形态学上的变化，如：染色质浓缩、核碎裂、细胞皱缩等，进而分裂成凋亡小体被免疫细胞吞噬[13]。在口腔领域中，细胞凋亡紊乱被认为是牙周炎、肿瘤、扁平苔藓等疾病的重要发病机制[14]。

Jarnbring等[15]认为慢性牙周炎牙周袋顶角质细胞较少，容易在炎症作用下发生细胞凋亡增加。牙周炎致病菌也可导致相关靶细胞凋亡而影响牙周炎的进展过程。冯利等[16]通过流式细胞术检测，发现细菌毒素诱导免疫细胞活化并促进细胞凋亡是侵袭性牙周炎的发病机制之一。Ekuni等[17]采用TUNEL法给牙周炎大鼠龈沟上皮细胞染色，发现牙龈成纤维细胞发生大量细胞凋亡。Gamonal等[18]在人慢性牙周炎牙龈组织中同样检测出降解DNA片段、及caspase-3等的表达。有体外细胞培养和病理组织切片发现，牙周组织损伤过程伴随细胞凋亡，但具体机制尚不清楚[18-20]。这些结果均表明，牙周组织的细胞凋亡与牙周炎发生发展相关。

3 Hp与细胞凋亡

Hp可分泌多种毒力因子，每种毒力因子的毒性都不相同。有学者通过胃黏膜组织Hp的研究发现，Hp特有的IV型分泌系统将CagA注入宿主细胞，从而激活各种信号酶，产生级联反应，影响细胞的信息通路传导，引起病理性细胞应答，最终导致细胞凋亡等变化。几乎所有的Hp菌株都有VacA基因，其可作为单一致病因子使哺乳动物上皮细胞发生多种明显的细胞病变效应[21]。Galmiche 等[22]研究发现HPVacA通过作用于线粒体而诱导细胞凋亡。编码HpVacA的基因在细胞质中表达后，能迁移到线粒体基质。据此推断，表达VacA基因的HP入侵哺乳动物后，可通过毒素活性调节线粒体膜通透性[23]，从而促进细胞色素C由线粒体释放到胞浆，并活化相关因子，进一步导致细胞凋亡[24]。

有学者研究Hp感染与整合素β1之间的关系，发现Hp促进细胞凋亡有2种途径，一种是毒力因子直接作用于宿主细胞诱导细胞凋亡，另一种是引起可抑制细胞凋亡的整合素β1的表达下降。研究证明，整合素β1亚基可与含Arg-Gly-Asp(RGD)序列的Hp的IV型分泌系统蛋白组分特异性结合，通过介导毒性蛋白的转运调节宿主细胞凋亡、增殖等生物学功能[25]。在以往胃炎的研究中，证实Hp感染产生的炎症介质、活性氧等可损伤细胞DNA，引发内环境失调，从而诱导细胞凋亡。在胃癌的研究中发现，Hp感染早期因细胞周期调控蛋白异常，发生细胞凋亡水平增加，随后Hp感染诱导COX-2表达促进PGE2合成，后者诱导细胞增殖并通过刺激Bc1-2表达抑制细胞凋亡，此时凋亡逐渐降低直至无凋亡，增殖活跃加速，最终突变的细胞生长不受限产生癌变。

在近十年的文献中，有不少学者采用流式细胞术对牙周膜成纤维细胞或牙龈上皮细胞进行Hp相关的体外细胞凋亡研究，共同证实了Hp作为单一因素与牙周组织细胞凋亡的相关性。有研究发现，Hp可以抑制hPDLFs的生长、分裂和增殖。HpCagA和VacA进入细胞后，均可启动细胞内发生广泛的rab7依赖的融合及晚期包裹小泡腔隙的渗透性肿胀，诱导细胞空泡化和细胞线粒体的超微结构改变，从而引起哺乳动物上皮细胞凋亡[26-27]。Galmiche 等[22]和Kim等[23]研究发现Hp VacA在细胞质表达后可将N端34 kD亚单位(p34)迁移到线粒体基质，而C端58 kD 亚单位(P58)则保留下来。Willhite等[28]的研究也证明了此观点。Chiozzi等[29]推断，Hp可通过毒素活性调节线粒体膜的通透性,从而活化凋亡相关因子半胱氨酸、天冬氨酸蛋白酶3酶原[30]，导致细胞凋亡。马玲等[31]将Hp VacA与人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblasts，hPDLFs)共同培养，发现hPDLFs生长受到抑制，细胞凋亡数量增加。hPDLFs是牙周膜中最多，在功能上也是最主要的细胞。一旦hPDLFs发生结构或性质的改变，都可能会引起牙周病损，进而导致或加重牙周组织疾病的发生。然而，目前并没有口腔Hp与细胞凋亡的体内研究。

过往研究表明，性别对Hp感染及牙周炎症意义不大[32]。因此，本实验并未将该因素纳入分组。实验选取健康牙龈组织进行分析，排除导致牙周疾病的常见红色致病菌的毒力协作，便于独立分析Hp感染对牙龈组织细胞凋亡的影响。在TUNEL法显色结果中，可见Hp感染组棕色凋亡细胞密集分布于上皮全层, 少数散在于固有层内。而正常对照牙龈组织中凋亡细胞相对较少, 两者AI值差异有统计学意义，推测Hp可导致牙龈组织细胞凋亡。但本次实验Hp阴性组结果仍高于以往国内对健康牙龈上皮细胞的凋亡细胞指数结果。可能因为样本对应牙齿均为牙折导致的残冠，其长期受到不平衡咬合力，而牙周组织是最容易因为受到压力而产生适应性改建的组织。有文献证实，长时间的压力可导致牙龈成纤维细胞凋亡。或许因为如此，本实验2组细胞的AI值都较高。另外，因本实验样本为活检组织，其坏死细胞和细胞代谢的反应亦呈阳性，使得凋亡细胞计数也会偏高。

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(责任编辑： 陈妙玲， 罗 森)

Correlation betweenHelicobacterpyloriinfection and apoptosis in gingival tissues

HUANG Shan, LAI Ren-fa, ZHONG Li-zhen

(DepartmentofStomatology,TheFirstAffiliatedHospitalofJinanUniversity,Guangzhou510632,China. E-mail： 13318818388@163.com)

AIM: To observe the effects ofHelicobacterpylori(Hp) on the apoptosis of human gingival tissue. METHODS: Gingival tissue samples were taken from 30 patients without chronic periodontitis, and Hp was detected by conventional PCR. The apoptosis of the gingivival cells was detected by terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) to analyze the correlation between Hp infection and apoptosis of the gingival tissues. RESULTS: The Hp positive detections were 12 in the 30 patients without periodontitis, so the positive rate of Hp in the gingival tissue samples was 40%. The gingival tissue showed a large number of apoptotic cells in Hp positive group, and less apoptotic cells in Hp negative group. The apoptotic index in Hp positive group (0.498±0.092) was significantly higher than that in normal group (0.207±0.053) (P<0.05). CONCLUSION: Hp might play a role in the apoptosis of gingival tissues.

Gingival tissue;Helicobacterpylori; Apoptosis

1000- 4718(2017)07- 1323- 06

2017- 02- 27

2017- 04- 20

R781.4； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.07.028

杂志网址： http://www.cjpp.net

△通讯作者 Tel: 13318818388; E-mail: 13318818388@163.com