张红萍， 袁 梅

(嘉兴市中医院检验科， 浙江 嘉兴 314001)

白藜芦醇通过促进Apaf-1/caspase-9复合物的形成增强5-氟尿嘧啶对骨肉瘤CD133+细胞亚群凋亡的诱导

张红萍△， 袁 梅

(嘉兴市中医院检验科， 浙江 嘉兴 314001)

目的： 探讨白藜芦醇联合化疗药物5-氟尿嘧啶对骨肉瘤CD133+细胞亚群的协同杀伤效应及机制。方法: 将人骨肉瘤细胞系MG-63 CD133+细胞亚群及相应CD133-细胞亚群用5-氟尿嘧啶及白藜芦醇进行体外处理。MG-63细胞的相对细胞活力用MTT法进行检测；细胞凋亡率用流式细胞术进行检测；用Western blot实验检测caspase-9和caspase-3的活化、Apaf-1的表达水平及细胞色素C的释放；用免疫共沉淀法检测Apaf-1与caspase-9前体的相互作用。结果: 5-氟尿嘧啶对MG-63 CD133+细胞亚群的杀伤活性和凋亡诱导活性均显著低于MG-63 CD133-细胞亚群。但联用白藜芦醇能显著提高5-氟尿嘧啶对MG-63 CD133+细胞亚群的细胞活力抑制率。白藜芦醇处理能显著上调MG-63 CD133+细胞亚群中Apaf-1的表达水平，在MG-63 CD133+细胞亚群中转染Apaf-1 siRNA后，5-氟尿嘧啶联用白藜芦醇的协同效应受到显著抑制。另外，免疫共沉淀实验结果表明白藜芦醇联合5-氟尿嘧啶能显著诱导MG-63 CD133+细胞亚群中Apaf-1/caspase-9复合物的形成，从而诱导caspase-9发生活化。结论: 白藜芦醇通过促进Apaf-1/caspase-9复合物的形成,增强5-氟尿嘧啶对骨肉瘤CD133+细胞亚群凋亡的诱导。

白藜芦醇; 5-氟尿嘧啶; 骨肉瘤; CD133+细胞亚群; Apaf-1; Caspase-9

骨肉瘤是一种好发于儿童和青少年的原发性恶性骨肿瘤[1]。在骨肉瘤的治疗中，化疗是一种不可替代的行之有效的治疗方法。然而在化疗过程中，肿瘤细胞会逐渐产生耐药性，从而大大限制了化疗的临床应用[2]。近期的研究表明癌症可以被认为是一种干细胞失调性疾病，肿瘤可能是由一种具有“干细胞样”的恶性细胞增殖形成的。CD133是一种表达于干细胞表面的糖蛋白，有研究发现在一些肿瘤细胞(如骨肉瘤细胞)表面也表达CD133，这些CD133+的肿瘤细胞相比于普通的CD133-肿瘤细胞具有更强的增殖能力、自我更新能力和耐药性，经鉴定这些CD133+的肿瘤细胞具有“肿瘤干细胞(can-cer stem cells，CSCs)”的特性[3-5]。5-氟尿嘧啶是尿嘧啶的同类物，在肿瘤细胞中通过阻断脱氧核糖尿嘧啶转化为胸腺嘧啶而干扰DNA的合成。因此5-氟尿嘧啶能阻断肿瘤细胞的DNA修复机制，从而使细胞进入凋亡程序[6-7]。然而，一些肿瘤细胞(特别是CD133+的肿瘤细胞)对5-氟尿嘧啶的治疗不敏感，并且分子机制也不十分清楚[8]。因此，研究CD133+细胞亚群如何产生对5-氟尿嘧啶抵抗的分子机制并采取辅助治疗手段提高CD133+细胞亚群对5-氟尿嘧啶的敏感性有十分重要的意义。

材 料 和 方 法

1 细胞培养

人骨肉瘤细胞系MG-63购于ATCC。CD133-FITC荧光抗体用于MG-63 CD133+细胞亚群的分选：将MG-63细胞系用CD133-FITC荧光抗体在暗处冰上孵育30 min，之后用生理盐水将细胞洗涤3遍后用流式细胞仪进行细胞分选，FITC荧光强度高的MG-63细胞即分选为MG-63 CD133+细胞亚群，FITC荧光强度弱的MG-63细胞即分选为MG-63 CD133-细胞亚群。MG-63 CD133+细胞亚群及MG-63 CD133-细胞亚群均培养在含10%胎牛血清的DMEM培养基中，在37 ℃恒温培养箱中培养，通入5% CO2。

2 实验试剂

噻唑蓝[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT]、白藜芦醇、Annexin V/PI凋亡检测试剂盒和5-氟尿嘧啶购于Sigma；CD133-FITC荧光抗体购于Miltenyi Biotec；DMEM培养基和胎牛血清购于Gibco；细胞蛋白提取液以及抗人cleaved caspase-9、cleaved caspase-3、caspase-9前体(pro-caspase-9)、Apaf-1、细胞色素C和β-actin的抗体购于CST；线粒体分离试剂盒购于碧云天生物科技有限公司；蛋白G免疫共沉淀琼脂糖珠购于Santa Cruz；Apaf-1 siRNA购于上海吉玛生物，正向序列为5’-UGCUCUACUACAUGAAGGAUU-3’, 反向序列为5’-UCCUUCAUGUAGUAGAGCAUU-3’； Lipofectami-ne 2000购于Invitrogen； ECL试剂盒购于Pierce。

3 方法

3.1Apaf-1基因沉默 为了抑制MG-63 CD133+细胞亚群中Apaf-1的蛋白表达，根据Apaf-1 mRNA编码区序列，设计了几对Apaf-1 siRNA，其中，正向序列为5’-UGCUCUACUACAUGAAGGAUU-3’, 反向序列为5’-UCCUUCAUGUAGUAGAGCAUU-3’的Apaf-1 siRNA具有良好的效果，能有效抑制MG-63细胞中Apaf-1蛋白的表达。在进行Apaf-1基因沉默实验时，将MG-63 CD133+细胞亚群接种在培养板上，孵育过夜后将Apaf-1 siRNA(终浓度为50 nmol/L)用Lipofectamine 2000转染入肿瘤细胞中，培养24 h。

3.2 5-氟尿嘧啶半数有效浓度(IC50)的测定 将MG-63 CD133+细胞亚群和MG-63 CD133-细胞亚群按每孔5×103接种在96孔板上孵育过夜，分成MG-63 CD133+细胞亚群组和CD133-细胞亚群组。2组细胞用0～10 μmol/L 5-氟尿嘧啶处理肿瘤细胞48 h，之后加入20 mL MTT (5 g/L)于37 ℃恒温培养箱中培养4 h，移除孔内培养基，加入100 μL二甲亚砜，570 nm波长下测定吸光度(A)。细胞活力结果用5-氟尿嘧啶处理组与对照组的A值比值表示。根据细胞活力实验结果曲线计算5-氟尿嘧啶对MG-63 CD133+细胞亚群和MG-63 CD133-细胞亚群的IC50。

3.3 细胞凋亡实验 实验分为MG-63 CD133-细胞亚群对照组、MG-63 CD133-细胞亚群5-氟尿嘧啶处理组、MG-63 CD133+细胞亚群对照组和MG-63 CD133+细胞亚群5-氟尿嘧啶处理组。将MG-63 CD133+细胞亚群或MG-63 CD133-细胞亚群按每孔5×105接种在6孔板上，孵育过夜使细胞完全贴壁。将5-氟尿嘧啶(终浓度为6 μmol/L)加入到培养体系中，培养48 h。之后将细胞用生理盐水洗涤2次，按照凋亡试剂盒说明书步骤将碘化丙啶和Annexin V加入细胞中孵育20 min，采用流式细胞术检测肿瘤细胞的凋亡，Annexin V阳性细胞即为凋亡细胞。

3.4 细胞活力的检测 实验分为MG-63 CD133+细胞亚群对照组、MG-63 CD133+细胞亚群白藜芦醇处理组、MG-63 CD133+细胞亚群5-氟尿嘧啶处理组、MG-63 CD133+细胞亚群5-氟尿嘧啶联合白藜芦醇处理组和MG-63 CD133+细胞亚群5-氟尿嘧啶+白藜芦醇+Apaf-1 siRNA处理组。将MG-63 CD133+细胞亚群按每孔5×103接种在96孔板上，孵育过夜使细胞完全贴壁。将Apaf-1 siRNA(终浓度为50 nmol/L)用0.5 μL的Lipofectamine 2000进行转染并用100 μL无血清培养基孵育6 h，之后将无血清培养基更换为100 μL有血清DMEM继续培养24 h。然后按照实验设计将白藜芦醇(终浓度为10 μmol/L，该浓度白藜芦醇对MG-63 CD133+细胞亚群细胞活力几乎无影响)及5-氟尿嘧啶(终浓度为6 μmol/L，该浓度5-氟尿嘧啶单独处理仅对MG-63 CD133+细胞亚群有轻微的细胞活力抑制作用)加入到培养体系中，培养48 h。之后加入20 μL MTT (5 g/L)培养4 h，移除孔内培养基，加入100 μL二甲亚砜，570 nm波长下测定A值。相对细胞活力结果用实验组与对照组的A值比值表示。

3.5 线粒体分离 使用线粒体分离试剂盒分离MG-63 CD133+细胞亚群的线粒体和细胞质，用以检测细胞质中细胞色素C的表达以确定白藜芦醇(终浓度为10 μmol/L)、5-氟尿嘧啶(终浓度为6 μmol/L)及Apaf-1 siRNA(终浓度为50 nmol/L)处理后MG-63 CD133+细胞亚群的细胞色素C的释放。

3.6 Western blot实验 实验分为对照组、白藜芦醇处理组、5-氟尿嘧啶处理组、5-氟尿嘧啶联合白藜芦醇处理组和5-氟尿嘧啶+白藜芦醇+Apaf-1 siRNA处理组。将MG-63 CD133+细胞亚群或MG-63 CD133-细胞亚群按每孔5×105接种在6孔板上，孵育过夜使细胞完全贴壁。将细胞用白藜芦醇(终浓度为10 μmol/L)、5-氟尿嘧啶(终浓度为6 μmol/L)和Apaf-1 siRNA(终浓度为50 nmol/L)处理后用蛋白提取液裂解细胞。裂解后的样品用12% SDS-PAGE进行分离。分离完毕后通过电转方法将蛋白质从分离胶上转到PVDF膜上，用抗cleaved caspase-9、cleaved caspase-3、pro-caspase-9、Apaf-1、细胞色素C和β-actin抗体孵育过夜，之后再用带辣根过氧化物酶的 II 抗孵育2 h，蛋白条带用ECL试剂盒显色发光。目的蛋白的相对表达用目标蛋白灰度值与β-actin灰度值的比值表示，蛋白灰度值分析用Image J软件处理。

3.7 免疫共沉淀 实验分为对照组、白藜芦醇处理组、5-氟尿嘧啶处理组、5-氟尿嘧啶联合白藜芦醇处理组和5-氟尿嘧啶+白藜芦醇+Apaf-1 siRNA处理组。将MG-63 CD133+细胞亚群用白藜芦醇、5-氟尿嘧啶和Apaf-1 siRNA处理后裂解细胞并将细胞在12 000 r/min下离心10 min，收取上清液分成等量2份，一份直接进行Western blot实验检测β-actin的表达作为对照，另外一份加入Apaf-1抗体孵育过夜。Apaf-1抗体孵育完毕后加入蛋白G琼脂糖珠孵育2 h。经过2 h免疫沉淀反应后进行Western blot实验，检测与Apaf-1结合的pro-caspase-9蛋白。结合pro-caspase-9蛋白的相对表达用目标蛋白灰度值与β-actin灰度值的比值表示。

4 统计学处理

所有实验重复3次，实验数据用均数±标准差(mean±SD)表示并用SPSS 15.0统计分析软件进行处理。两组间均数的比较采用 Student’st检验，多组间均数的比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 MG-63 CD133+细胞亚群对5-氟尿嘧啶的敏感性显著低于MG-63 CD133-细胞亚群

流式细胞术实验结果显示MG-63 CD133+细胞亚群高表达CD133，而MG-63 CD133-细胞亚群不表达CD133，表明通过细胞表面标记CD133能将MG-63骨肉瘤细胞分为CD133+细胞群体和CD133-细胞群体。MTT细胞活力实验结果显示MG-63 CD133+细胞亚群对5-氟尿嘧啶(0～10 μmol/L)的敏感性显著低于MG-63 CD133-细胞亚群。直观地看，5-氟尿嘧啶对MG-63 CD133+细胞亚群的IC50显著高于MG-63 CD133-细胞亚群，表明骨肉瘤CD133+细胞亚群对5-氟尿嘧啶有耐药性。流式细胞术实验结果显示MG-63 CD133+细胞亚群在5-氟尿嘧啶(6 μmol/L)处理下的凋亡率显著低于MG-63 CD133-细胞亚群，同时MG-63 CD133+细胞亚群在5-氟尿嘧啶的处理下，caspase-9和caspase-3的活化程度显著低于MG-63 CD133-细胞亚群，这些结果表明骨肉瘤CD133+细胞亚群对5-氟尿嘧啶诱导的凋亡信号不敏感，见图1。

2 白藜芦醇提高MG-63 CD133+细胞亚群对5-氟尿嘧啶的敏感性

MTT细胞活力实验结果显示5-氟尿嘧啶(6 μmol/L)单独处理对MG-63 CD133+细胞亚群的杀伤活性较弱，然而联合白藜芦醇后，5-氟尿嘧啶对MG-63 CD133+细胞亚群的杀伤活性显著提高，表明白藜芦醇辅助治疗能提高骨肉瘤CD133+细胞亚群对5-氟尿嘧啶的敏感性。Western blot实验结果显示MG-63 CD133+细胞亚群中Apaf-1蛋白的表达水平显著低于MG-63 CD133-细胞亚群，提示骨肉瘤CD133+细胞亚群可能通过Apaf-1途径抵抗5-氟尿嘧啶的抗肿瘤活性。同时，实验结果显示白藜芦醇能显著上调MG-63 CD133+细胞亚群中Apaf-1的表达水平，提示白藜芦醇在MG-63 CD133+细胞亚群中对5-氟尿嘧啶的协同作用可能与Apaf-1的上调有关。进一步的实验结果显示在MG-63 CD133+细胞亚群中转染Apaf-1 siRNA沉默Apaf-1的表达后，白藜芦醇联合5-氟尿嘧啶对MG-63 CD133+细胞亚群的杀伤活性受到显著抑制，证实了白藜芦醇通过上调Apaf-1的表达提高MG-63 CD133+细胞亚群对5-氟尿嘧啶的敏感性，见图2。

Figure 1.The sensitivity of MG-63 CD133+cell subset to 5-fluorouracil was significantly lower than that of MG-63 CD133-cell subset. A: sorting efficiency of MG-63 CD133+cell subset and MG-63 CD133-cell subset was analyzed by flow cytometry； B: the IC50of 5-fluorouracil for MG-63 CD133+cell subset was significantly higher than that for MG-63 CD133-cell subset; C: the apoptotic rate of MG-63 CD133+cell subset treated with 5-fluorouracil (6 μmol/L) was significantly lower than that of MG-63 CD133-cell subset; D: activation of caspase-9 and caspase-3 in the MG-63 CD133+cell subset treated with 5-fluorouracil was significantly lower than that in the MG-63 CD133-cell subset. Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01vsMG-63 CD133-cell subset (control);#P<0.05vsMG-63 CD133+cell subset control;△P<0.05vs5-fluorouracil-treated MG-63 CD133-cell subset.

图1 MG-63 CD133+细胞亚群对5-氟尿嘧啶的敏感性显著低于MG-63 CD133-细胞亚群

Figure 2.Resveratrol increased the sensitivity of MG-63 CD133+cell subset to 5-fluorouracil by downregulating the expression of Apaf-1. A: resveratrol enhanced the cytotoxicity of 5-fluorouracil to MG-63 CD133+cell subset; B: the expression of Apaf-1 was significantly lower in the MG-63 CD133+cell subset than that in the MG-63 CD133-cell subset; C: resveratrol significantly downregulated the expression of Apaf-1 in the MG-63 CD133+cell subset; D:Apaf-1 siRNA inhibited the cytotoxicity of the co-treatment with 5-fluorouracil and resveratrol in the MG-63 CD133+cell subset. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vs5-fluorouracil group;△P<0.05vsMG-63 CD133-cell subset;▲P<0.05vsresveratrol+5-fluorouracil group.

图2 白藜芦醇通过下调Apaf-1的表达提高MG-63 CD133+细胞亚群对5-氟尿嘧啶的敏感性

3 白藜芦醇联合5-氟尿嘧啶诱导Apaf-1/caspase-9复合物的形成

研究表明，只有在细胞色素C的存在下，caspase-9前体才能通过与Apaf-1的结合而发生活化[9]。本实验结果显示5-氟尿嘧啶能显著诱导细胞色素C从线粒体释放到细胞质中，而与白藜芦醇无关。另外，白藜芦醇单独处理虽能上调MG-63 CD133+细胞亚群中Apaf-1的表达却不能直接诱导Apaf-1与caspase-9的相互作用，而白藜芦醇联合5-氟尿嘧啶不仅能上调MG-63 CD133+细胞亚群中Apaf-1的表达，同时也能诱导Apaf-1与caspase-9的相互作用，这些结果表明5-氟尿嘧啶通过诱导细胞色素C的释放介导细胞的凋亡，而白藜芦醇通过上调Apaf-1的表达促进5-氟尿嘧啶诱导的Apaf-1/caspase-9复合物的形成。另外，Western blot实验结果显示白藜芦醇联合5-氟尿嘧啶能显著活化caspase-9及其下游效应分子caspase-3。沉默Apaf-1的表达后，白藜芦醇则不能促进5-氟尿嘧啶对caspase-9的活化，表明白藜芦醇通过上调Apaf-1的表达促进5-氟尿嘧啶对caspase-9及其下游效应分子caspase-3的活化，见图3。

Figure 3.Resveratrol promoted the activation of caspase-9 through upregulating the expression of Apaf-1. A: 5-fluorouracil induced the release of cytochrome C in the MG-63 CD133+cell subset; B: resveratrol promoted 5-fluorouracil-induced interaction between Apaf-1 and pro-caspase-9 through upregulating the expression of Apaf-1 in the MG-63 CD133+cell subset; C: co-treatment with resveratrol and 5-fluorouracil significantly triggered the activation of caspase-9 and caspase-3 in the MG-63 CD133+cell subset. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vs5-fluorouracil group;△P<0.05vsresveratrol+5-fluorouracil group.

图3 白藜芦醇通过上调Apaf-1的表达促进caspase-9的活化

讨 论

肿瘤组织中CD133+细胞亚群的存在是造成药物抵抗的重要因素，因此CD133+细胞亚群是肿瘤治疗的重要靶点[10]。白藜芦醇是一种有很强药理活性的天然多酚类物质，对多种疾病均有良好的治疗效果。近期的研究表明白藜芦醇还有十分良好的抗肿瘤效应，如白藜芦醇可抑制结直肠癌细胞的增殖和转移[11]，还可通过ROS途径诱导卵巢癌细胞的死亡[12]。另外，白藜芦醇联合雷帕霉素还可有效治疗膀胱癌[13]。尽管如此，白藜芦醇对CD133+细胞亚群的辅助治疗作用至今还很少报道。在本研究中，实验结果表明白藜芦醇单独处理虽不能显著杀伤骨肉瘤CD133+细胞亚群，但其却能显著提高5-氟尿嘧啶对骨肉瘤CD133+细胞亚群的杀伤能力，两者联合治疗对骨肉瘤CD133+细胞亚群有协同效应。

研究表明5-氟尿嘧啶能诱导肿瘤细胞发生线粒体途径的凋亡，使细胞色素C等凋亡诱导因子从线粒体中释放到细胞质中从而激活细胞的凋亡通路[14-15]。在细胞色素C依赖的凋亡信号通路中，下游分子caspase-9的活化至关重要，活化的caspase-9能直接激活caspase-3这一效应分子，进而使肿瘤细胞的DNA发生片段化而发生凋亡[16-17]。研究表明在细胞色素C活化caspase-9的过程中，Apaf-1蛋白的参与至关重要。Apaf-1是一个分子量为130 kD 的凋亡相关蛋白，有多个caspase结合位点。细胞质中的Apaf-1在细胞色素C的活化下能与caspase-9前体结合，从而激活caspase-9并诱导细胞发生caspases依赖的凋亡[18-19]。在本研究中，实验结果表明白藜芦醇增强5-氟尿嘧啶对骨肉瘤CD133+细胞亚群杀伤活性的机制和其能上调Apaf-1的表达有关。5-氟尿嘧啶能引起骨肉瘤CD133+细胞亚群细胞色素C的释放，而白藜芦醇可能通过上调Apaf-1的表达增加其与caspase-9的结合，从而增强caspase-9的活化和凋亡，因此5-氟尿嘧啶和白藜芦醇存在协同抗肿瘤作用。

综上所述，本研究证明了白藜芦醇能显著提高骨肉瘤CD133+细胞亚群对5-氟尿嘧啶的敏感性。通过机制研究我们发现白藜芦醇能通过上调Apaf-1的表达使骨肉瘤CD133+细胞亚群中的caspase-9在细胞色素C的作用下与Apaf-1结合而发生活化，进而使骨肉瘤CD133+细胞亚群进入凋亡程序。这些研究为逆转5-氟尿嘧啶对骨肉瘤的耐药性提供了新的思路和理论依据。

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(责任编辑： 卢 萍, 罗 森)

Resveratrol enhances 5-fluorouracil-induced apoptosis of osteosarcoma CD133+cell subset by promoting formation of Apaf-1/caspase-9 complex

ZHANG Hong-ping, YUAN Mei

(DepartmentofClinicalLaboratory,JiaxingHospitalofTraditionalChineseMedicine,Jiaxing314001,China.E-mail:jxyuanhongping@163.com)

AIM: To investigate the synergistic effect of resveratrol and 5-fluorouracil on osteosarcoma CD133+cell subset. METHODS: Human osteosarcoma cell line MG-63 CD133+cell subset and the corresponding CD133-cell subset were treated with resveratrol and 5-fluorouracil. After treatment, the viability of MG-63 cells was measured by MTT assay. The apoptosis of MG-63 cells was analyzed by flow cytometry. Activation of caspase-9 and caspase-3, the expression of Apaf-1, and the release of cytochrome C were evaluated by Western blot. The interaction between Apaf-1 and pro-caspase-9 was detected by co-immunoprecipitation. RESULTS: The cell death and apoptosis of MG-63 CD133+cell subset induced by 5-fluorouracil were significantly weaker than those in the corresponding MG-63 CD133-cell subset. However, co-treatment with resveratrol significantly enhanced the effect of 5-fluorouracil on inhibiting the viability of MG-63 CD133+cell subset. Mechanically, treatment with resveratrol upregulated the expression of Apaf-1. Transfection withApaf-1 siRNA abolished the synergistic effect of resveratrol and 5-fluorouracil in MG-63 CD133+cell subset. In addition, the results of co-immunoprecipitation indicated that the combination of resveratrol and 5-fluorouracil significantly induced the formation of Apaf-1/pro-caspase-9 complex, leading to the activation of caspase-9 in MG-63 CD133+cell subset. CONCLUSION: Resveratrol enhances 5-fluorouracil-induced apoptosis of osteosarcoma CD133+cell subset by promoting the formation of Apaf-1/caspase-9 complex.

Resveratrol; 5-Fluorouracil; Osteosarcoma; CD133+cell subset; Apaf-1; Caspase-9

1000- 4718(2017)07- 1196- 07

2016- 12- 14

2017- 02- 22

R735.7； R965

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.07.007

杂志网址： http://www.cjpp.net

△ 通讯作者 Tel: 0573-82088505； E-mail： jxyuanhongping@163.com