程占军 马大君

繁育·饲养

蒙古犬线粒体DNA D-loooopp区序列全长测定及其分类地位研究

程占军 马大君

作为人类最持久、可靠和忠诚的伙伴，早在10000～15000年前，一些与狼分道扬镳的野犬已经开始跟随原始人类一起生活。蒙古犬和其它犬一样具有体型强健、食肉性、凶猛性、服从性、敏捷性、嗅觉灵敏、听觉灵敏以及季节性繁殖和换毛等生物学特性。目前蒙古犬的中心地带，应以呼伦贝尔草原为核心地带。据史料记载推测，蒙古民族，即早期的蒙古部（蒙兀室韦）在今内蒙古自治区呼伦贝尔草原的呼伦湖和额尔古纳河东南的大兴安岭山林中繁衍生息时，现今呼伦贝尔草地牧羊犬的祖先，一个古老的山地犬种，已经在蒙古部族的营地里承担狩猎大型猎物、护卫营地和驮运物资等工作了。关于这个犬种，历史上没有留下任何记载，但为了适应冬季极度高寒的严酷山地环境，并与大型野兽搏杀，相信那应该是一种体大毛厚极有力量的凶猛犬种。公元9世纪中叶，蒙古部向西迁移，走出山林进入呼伦贝尔草原，逐步完成由纯粹的狩猎民族向半狩猎半游牧生活的过度，并最终成为真正意义上的游牧民族。蒙古游牧民族带着他们的畜群逐水草而居，不定期地更换牧场。这个犬种逐渐对这种游牧生活进行了适应，在无边界的牧场中，它们高声吠叫，警告陌生人并向主人发出信号，护卫营地和放牧羊群，驱除觊觎羊只的野狼。由于从上世纪90年代初期开始，受东北朝鲜饮食文化的影响，在一些中心城市海拉尔、满洲里和牙克石等地开始零星出现狗肉餐馆，每天杀犬几十头，而一些小地方，也在十几头左右，致使蒙古犬的基础群数量正在逐年下降。据估算，目前全国现存蒙古犬的总数约50000头。

高等动物线粒体DNA（mtDNA）由于具有含量丰富、结构简单、遗传方式单一、进化速度快等优点，已成为物种起源、分子进化和系统发育研究的重要分子标记。近年来在近缘种间及种群内群体间的分子进化研究中，D-loop 区已被广泛用于犬的起源与进化、群体遗传结构、品种间的系统发育关系等方面的研究。笔者测定了蒙古犬线粒体DNA D-loop区的全序列， 从分子水平上探讨了线粒体的起源和在犬科中的分类地位， 为线粒体种质资源的保护、利用提供理论依据。

一、材料与方法

（一）实验动物

实验动物为成年健康的纯种蒙古犬5头， 来自内蒙古自治区呼伦贝尔草原。经耳动脉采血5mL，ACD抗凝，采用常规的酚/氯仿法提取血液基因组DNA，0.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

选取家犬亚种中已经测出线粒体DNA D-loop区全序列的、具有代表性的24个家犬品种和两个灰狼、郊狼。从GenBank数据库中下载其线粒体DNA D-loop区全序列(表1)，与进行系统发育分析，并选取与家犬亚种亲缘关系较近的郊狼作为系统发育分析的外类群。

（二）引物设计与PCR扩增

根据家犬线粒体基因组的已知DNA 序列(序列号: U96639) 用Primer Premier 5.0软件设计引物扩增蒙古犬和藏獒线粒体DNA的D-loop区，正向引物为：5′AGCTGAAATTCTTCTTAAACTATTCCCTG3′，反向引物为：5′GTGTGGCTTAGCAAGGTGTTATGAG 3′；测序引物为M13 通用引物，均由上海英骏生物技术有限公司合成。

PCR 扩增反应总体积为15ul，其中100ng模板DNA、10×Buffer、2.5 mmol· L-1dNTP 1.5ul、2.5 mmol· L-1MgCl2 1ul、10 umol· L-1的引物各 0.35ul、Taq DNA聚合酶 0.15ul。反应条件为：94℃预变性3min，30个循环（94℃变性45s，52℃退火50s，72℃延伸2min），72℃延伸7min。

（三）目的基因测序

PCR 产物经W5212 柱离心式胶回收试剂盒纯化后作为测序反应的模板。测序仪器为ABI3130，所用试剂盒(Kit)为: ABI PrismBigDyeTM Terminator Cycle Sequecing Ready ReactionKit (ABI，USA) 。测序反应体系内含模板40 ng(PCR 产物) 、BigDye Mix 2μL 、引物1μL (浓度为3.2μmol/L)，用灭菌的ddH2O 补足10μL。然后根据Kit 推荐的反应条件进行sequencePCR。测序反应产物经纯化(参照ABI，USA)，用ABI3130全自动测序仪进行正反链双向测序。DNA序列通过ABI3130 测序收集软件(2.0)和分析软件(3.4.1) 确定。所有序列采用双向测序，以便比对核实。

（四）数据处理与系统发生分析

用DNAStar5.02(DNASTAR Inc1，1996)软件的SeqMan程序对所测序列拼接，用MEG程序对所测序列和数据库中的序列进行比对分析、对位排列；用Mega4.1统计序列的碱基组成、转换与颠换的比值和遗传距离；利用MEGA4.1软件中的NJ邻接法构建NJ树和最小进化法构建系统发育树，选用Kimura 2-parameter模型，重复抽样检验1000次获得自举置信度。

二、结果

（一）基因片段序列及差异

设计的引物在蒙古犬基因组中得到了较好地扩增，通过测序发现蒙古犬线粒体DNA D-loop区序列全长为1278 bp对于5头蒙古犬序列的统计发现T、C、A、G4种碱基的平均含量分别为29.1%、26.4%、27.3%、17.2%，A+T=56.39%，C+G=43.61%。碱基序列中A、T含量明显高于G、C含量，说明序列碱基存在明显的偏向性。在密码子的不同位点，碱基频率有不同偏倚，密码子第一位T、C、A、G的平均含量分别是40%、27.4%、17.6%、15%；密码子第二位T、C、A、G的平均含量分别是13%、45.7%、36.3%、5.1%；密码子第三位T、C、A、G的平均含量分别是20%、24.5%、26.5%、28.6%。与犬科其他物种的线粒体DNA D-loop区序列的碱基组成基本一致。

表1 本研究中所用实验样本

DNA序列片段经DNA Star 5.02软件的SeqMan程序拼接，并反向重复测序进行校正后，得到完整的犬D-Loop基因序列，不同品种间线粒体DNA D-loop区序列相差较大， 介于1240bp与1278bp 之间，蒙古犬的线粒体DNA D-loop区序列最长，为1278bp左右，再用DNAstar进行同源序列比对。由于同种个体之间的序列差异很小(0-0.003)，因此大多数物种选用1 例个体代表该物种来进行分析。用Mega4.1进行核酸序列分析转换/颠换比率的平均值R=33.91，若转换与颠换的比值（R）小于2.0时，认为该基因序列发生的突变已经达到饱和。

通过比对，发现蒙古犬线粒体DNA D-loop 区中包括2个保守序列模块即CSBⅠ和CSBⅡ， 而在2个保守序列模块之间有1个短片段重复区，这个重复区是由一个包含10个核苷酸构成的重复单元5′-GTACACGT(G/A)C-3′经过31个重复形成的，类似于藏獒的30个重复。

（二）遗传距离

利用Mega4.1进行遗传距离计算。从表2可以看出，蒙古犬与灰狼（DQ_480508）、贵宾犬、和圣伯纳犬遗传距离最近，均为0.003；蒙古犬与郊狼的遗传距离较远（0.042~0.049）。

2.3 系统进化分析

根据线粒体DNA D-loop区全序列， 分别采用NJ法和ME法构建了蒙古犬与24个家犬品种的系统发育树(如图1)，结果发现NJ树和ME树的拓扑结构基本一致；其中郊狼与美国郊狼聚为一类；所有家犬品种自成一大类。在家犬品种内， 迷你雪纳瑞犬、西高地白、兰伯格犬、爱尔兰雪达犬、英国古代牧羊犬、美国可卡犬、爱尔兰软毛麦色、西伯利亚哈士奇犬和藏獒聚分第一分支；灰狼（DQ480508 NC_008093）、英国平毛寻回猎犬、中国蒙古犬、贵宾犬、喜乐蒂牧羊犬、圣伯纳犬节点聚为第二分支；灰狼（DQ480503）与黑俄罗斯、瑞典猎鹿犬和德国牧羊犬等品种聚为第三分支。

三、讨论

蒙古犬线粒体DNA D-loop区的重复序列与家犬、猪的重复序列非常相似，在10个核苷酸重复单元中的第9个碱基发生G/A替换。存在一段以10个碱基为单位的串连重复序列，一般认为这是mtDNA异质性的表现，直接影响犬线粒体DNA的长度。线粒体DNA D-loop区中重复序列的可变性和重复单元数量的可变性所形成的异质性是哺乳动物线粒体DNA的典型特征。在犬科动物的线粒体DNA中只有1个重复序列， 位于CSBⅠ和CSBⅡ之间；而在猫科动物的线粒体DNA中有2个重复序列，即位于CSBⅠ与CSBⅡ之间的RS3和位于tRNA-pro与保守核心区之间的RS2；在兔科动物的线粒体DNA中短片段重复序列位于CSBⅠ与CSBⅡ之间，而长片段重复序列位于tRNAPhe和CSBⅢ之间。蒙古犬及16个家犬品种间线粒体DNA D-loop 区碱基的缺失/插入在重复序列和非重复序列中均有发生，验证了Kim等提出的“与其他一些哺乳动物如海豹、马、猪、驴、兔和猫等不同，犬线粒体DNA D-loop区中的重复序列并不是引起犬线粒体DNA序列长度多态性的唯一原因”的观点。蒙古犬及16个家犬品种间线粒体DNA D-loop区序都得养三五头犬。蒙古犬有三大类：一类是牧羊犬，又称蒙古獒，体格壮硕、聪敏机智、秉性忠诚、勇敢凶猛异常；蒙元时期蒙古人还驯养着一种雄壮的劳役犬蒙古獒（俗称四眼狗）专门用来套雪橇拉车；列的转换/颠换比为33.91， 明显大于转换/颠换比的临界值2.0，表现出较高的转换偏爱性，与其他哺乳动物线粒体DNA序列的研究结果是一致的，同时也说明蒙古犬及16个家犬品种间线粒体DNA D-loop区序列的突变没有达到饱和状态。

表2 各群体间的遗传距离

将蒙古犬D-loop部分序列与已知序列构建了进化数，结果表明，不同地区的品种混合聚类，说明欧亚大陆的家犬品种在历史上曾发生过相当程度的基因交流。本研究发现蒙古犬与灰狼（DQ480508 NC_008093）、英国平毛寻回猎犬、贵宾犬、喜乐蒂牧羊犬、圣伯纳犬聚为一类， 其中与圣伯纳犬聚在一起。据史料记载，蒙古人爱养犬，在草原上每家蒙古犬中还有一种玩赏狗，体形娇小，形态可爱。蒙古犬和藏獒一样强壮，直到70～80年代一位兽医Sevenjav DT作了调查研究以后，才作出了蒙古犬身材形态的准确描述。这说明蒙古犬在品种形成过程中，其分类型可能与这几类犬有关。从系统进化关系看，所有家犬都起源于灰狼，而与郊狼关系较远。Vila等认为家犬是在不同的时间、地点分别起源；而Savolainen等认为家犬全部起源于东亚，在亚洲向欧洲的扩散过程中发生了变异或遗传漂变，产生了多个类群。经过多年的争论和深入研究，目前已基本达成共识， 即世界范围内的所有家犬都起源于灰狼。

图1 基于犬线粒体DNA D-loop 区序列采用NJ 法(A) 和ME法(B ) 构建的系统发育树

（作者单位：公安部南京警犬研究所，210012）

（编辑：李 冰）