娄潇雨,童群义

(江南大学食品学院,江苏无锡 214112)



超声波辅助碱液-酶解法对柚皮脱苦效果的研究

娄潇雨,童群义*

(江南大学食品学院,江苏无锡 214112)

在柚皮产品深加工中,为了使柚皮达到更好的脱苦效果,以柚皮脱苦率为指标,采用超声波辅助碱液-酶解法对柚皮进行脱苦。经单因素和正交实验得出超声波辅助碱液法优化工艺条件为:料液比1∶30 (g/mL),超声时间20 min,超声温度55 ℃,超声功率120 W,所得脱苦率为75.31%。在超声波优化基础上,通过响应面优化实验对柚皮进行柚苷酶酶解处理,其优化条件为:酶添加量0.15%,酶解温度52 ℃,酶解pH4.1,酶解时间36 min,所得柚皮脱苦率为90.14%。此方法与传统柚苷酶酶解法相比,具有更高的脱苦效率。

超声波，柚苷酶，柚皮，脱苦

柚子是芸香科柑橘属水果,因其皮厚耐藏,清香诱人,被誉为“天然的水果罐头”。据明·李时珍《本草纲目》记载:“柚,功能消食,解酒毒,去肠胃中恶气,长发滋燥,疗妊妇不思食口淡”。柚皮占整个柚子的43%～48%[1],除含有水分、维生素和矿物质这些人体必需的营养素外,还含有多种对人体健康有益的非营养性生理活性成分,其中含有的苦味物质如柚皮苷和柠檬苦素,是限制柚皮加工利用的最主要因素。柚皮苷是一种黄酮类化合物,其含量高达苦味物质的80%[2],它的存在导致柚皮产生强烈的“前苦味”[3]。目前国内关于柚皮的脱苦方法主要有以下四种,即利用柚皮苷易溶于碱性溶液的性质而进行脱苦的盐碱浸泡法、采用活性炭和大孔吸附树脂等对苦味物质进行吸附的吸附脱苦法、β-环糊精包埋法和柚苷酶酶解法。其中柚苷酶酶解法因其酶解专一性强,反应条件温和、易于控制,对营养成分和风味物质的影响较小[4]而得到广泛应用,通常脱苦时间为80～142 min[5-7]。本实验通过采用超声波辅助碱液-酶解法对柚皮进行脱苦,以期缩短反应时间,提高脱苦效率,超声波辅助碱液-酶解法脱苦技术依次包含超声波辅助碱液处理和柚苷酶酶解两个阶段。首先利用柚皮苷在碱性溶液下开环溶解的性质[8],以NaHCO3溶液[9]为脱苦液,在超声机械效应和空化效应下,使柚皮结构造成一定程度的松动,加快苦味物质的溶出,之后采用柚苷酶进一步酶解,达到去除柚皮大部分苦味物质的目的。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

琯溪蜜柚 原产地福建省平和县;柚苷酶(酶活150 U/g) 上海宝丰生化有限公司;柚皮苷(色谱纯) 上海金穗生物科技有限公司;食品级碳酸氢钠 桐柏博源新型化工有限公司;氢氧化钠(分析纯) 江苏常陵化学试剂厂;柠檬酸(分析纯) 江苏常陵化学试剂厂;一缩二乙二醇(化学纯) 江苏常陵化学试剂厂。

KQ3200DE型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;HH-2k8型恒温水浴锅 巩义市予华仪器有限公司;DZF型真空干燥箱 上海科恒实业发展有限公司;SF-100型不锈钢高速粉碎机 上海船浜制药粉碎设备厂;UV-2100紫外-可见分光光度计 尤尼柯(上海)仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 柚皮脱苦方法 柚子清洗→柚皮切片→超声波辅助碱液法→冲洗沥干→柚苷酶酶解法

1.2.2 柚皮苷含量测定 采用戴维斯(Davis)[10]法对柚皮中柚皮苷含量进行测定。

1.2.2.1 标准曲线测定 将标准柚皮苷在110 ℃干燥至恒重,称取20.00 mg,添加20 mL 0.1 mol/L NaOH,用4 mol/L NaOH调pH至12,浸泡30 min后,再用20%柠檬酸溶液调pH至6,加水定容至100 mL,得柚皮苷标准液。分别吸取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL的标准液,于6支具塞试管中,分别添加试剂空白液5.0、4.0、3.0、2.0、1.0、0 mL,再各加5 mL 90%一缩二乙二醇和0.1 mL 4 mol/L NaOH,置于40 ℃恒温水浴中进行显色反应10 min,然后立即注入1 cm比色皿中,在420 nm波长处测吸光度,以吸光值对柚皮苷浓度作图,绘制标准曲线,得到回归方程为y=0.0657x-0.0021,R2=0.9991。

1.2.2.2 脱苦前样品处理 新鲜柚皮清洗之后,切成长20～30 mm、宽5～10 mm、厚0.5～1.0 mm的薄片,经70 ℃烘干之后粉碎,过100目筛。取一定量的粉末,添加 0.1 mol/L NaOH 20 mL,用4 mol/L NaOH调pH至12,浸泡30 min后,用20%柠檬酸调pH至6,加水定容至100 mL。经滤纸过滤,收集澄清液为样液,待测。

1.2.2.3 脱苦后样品处理 柚皮脱苦之后清洗沥干,经70 ℃烘干之后粉碎,过100目筛,之后步骤同1.2.2.2。

1.2.2.4 样品测定 精确吸取样液3 mL于2支具塞试管中,加试剂空白液至5 mL,各加5 mL 90%二甘醇,再分别加4 mol/L NaOH 0.0和0.1 mL,摇匀后以标准曲线同样的方法进行显色和测定,以加碱管的吸光度减去不加碱管中的吸光值,经查找标准曲线,即得所取样液中柚皮苷含量毫克数。

1.2.2.5 脱苦率计算 采用以下公式计算:

柚皮脱苦率(%)=(脱苦前柚皮苷含量-脱苦后柚皮苷含量)/脱苦前柚皮苷含量×100

1.2.3 超声波辅助碱液法柚皮脱苦工艺条件优化

1.2.3.1 单因素实验 以柚皮脱苦率为指标,结合柚皮感官性状,考察超声波料液比(g/mL)、超声时间(min)、超声温度(℃)和超声功率(W)4个因素(对柚皮脱苦效果的影响,以确定后续正交实验各因素水平。

料液比:分别称取5.0 g切好的柚皮于5个烧杯中,分别以料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 (g/mL)加入2% NaHCO3,在超声功率105 W,超声时间20 min,超声温度50 ℃下,对柚皮进行脱苦。

超声时间:分别称取5.0 g切好的柚皮于5个烧杯中,添加料液比为1∶30 (g/mL),超声功率105 W,超声温度50 ℃,超声时间为别为10、20、30、40、50 min,对柚皮进行脱苦。

超声温度:分别称取5.0 g切好的柚皮于5个烧杯中,添加料液比为1∶30 (g/mL),超声功率105 W,超声时间20 min,超声温度分别为30、40、50、60、70 ℃,对柚皮进行脱苦。

超声功率:分别称取5.0 g切好的柚皮于5个烧杯中,添加料液比为1∶30 (g/mL),超声时间20 min,超声温度50 ℃,超声功率分别为90、105、120、135、150 W,对柚皮进行脱苦。

1.2.3.2 正交实验 在单因素实验的基础上,采用正交实验对超声脱苦工艺条件进行优化。因素水平表见表1。

表1 超声波正交实验因素和水平Table 1 Factors and levels in the orthogonal array design for the optimization of ultrasonic pretreatment

1.2.4 柚苷酶酶解法条件优化

1.2.4.1 单因素实验 柚皮经超声波辅助碱液法最佳工艺处理后,将柚皮冲水沥干,进一步运用柚苷酶酶解法进行脱苦处理。以柚皮脱苦率为指标,结合柚皮感官性状,考察柚苷酶添加量(%)、酶解温度(℃)、酶解pH和酶解时间(min)4个因素对柚皮脱苦效果的影响,以响应面优化法确定酶解最佳工艺。

柚苷酶添加量:超声法脱苦之后的柚皮,在酶解pH4.0,酶解温度55 ℃,酶解时间40 min的条件下,分别研究0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%柚苷酶添加量对柚皮脱苦效果的影响。

酶解温度:超声法脱苦之后的柚皮,在柚苷酶添加量0.15%,酶解pH4.0,酶解时间40 min的条件下,分别研究45、50、55、60、65 ℃的酶解温度对柚皮脱苦效果的影响。

酶解pH:超声法脱苦之后的柚皮,在柚苷酶添加量0.15%,酶解温度55 ℃,酶解时间40 min的条件下,分别研究3.0、3.5、4.0、4.5、5.0的酶解pH对柚皮脱苦效果的影响。

酶解时间:超声法脱苦之后的柚皮,在柚苷酶添加量0.15%,酶解温度55 ℃,酶解pH4.0的条件下,分别研究20、30、40、50、60 min的酶解时间对柚皮脱苦效果的影响。

1.2.4.2 响应面优化实验 在超声波辅助碱液处理和酶解单因素实验的基础上,选取主要影响因子,以柚皮脱苦率为响应值,运用Design Expert 8.0软件结合Box-Behnken的中心组合实验设计原理进行响应面分析,最终得到优化实验工艺参数,并进行验证性实验。因素水平表见表2。

表2 柚苷酶酶解Box-Behnken实验因素水平表Table 2 Factors and levels in the Box-Behnken for the hydrolysis rate of naringin

2 结果与分析

2.1 超声波辅助碱液法柚皮脱苦工艺条件优化

2.1.1 料液比对柚皮脱苦率的影响 由图1可知,柚皮脱苦率随着料液比的增加而增大,当达到1∶30 (g/mL)时,变化趋于平缓,再增加碱液的量,脱苦率变化很小,且柚皮具有明显的碱味。综合考虑经济成本以及柚皮感官性状,初步选择1∶30 (g/mL)的料液比。

图1 料液比对柚皮脱苦率的影响Fig.1 Effect of material/liquid ratio on removal rate of naringin

2.1.2 超声处理时间对柚皮脱苦率的影响 如图2所示,随着超声处理时间的延长,柚皮细胞破坏程度增大,促进了柚皮苷和色素的溶出,柚皮脱苦率升高,风味变淡,色泽变浅,且碱味越来越明显。当达到30 min后,柚皮碱味突出,且脱苦率稍有降低,分析原因可能是长时间的超声波剧烈振动产生的热效应导致温度过高,在一定程度上减弱了超声波的空化效应,使得脱苦率降低[11]。综合考虑柚皮感官性状以及脱苦效果,选择最适超声时间为20 min,此时所得柚皮具有独特清香气味,无异味,感官性状较好。

图2 超声时间对柚皮脱苦率的影响Fig.2 Effect of ultrasound treatment time on removal rate of naringin

图3 超声温度对柚皮脱苦率的影响Fig.3 Effect of ultrasound temperature on removal rate of naringin

2.1.3 超声处理温度对柚皮脱苦率的影响 如图3所示,随超声温度的升高,柚皮脱苦率增大,当温度达到50 ℃时,脱苦率达到最高值,随着温度的进一步升高,脱苦率稍有降低,原因可能是在超声波热效应的影响下,超声温度过高,气泡中蒸汽压增大,缓冲作用增强而使超声波空化作用减弱,从而降低了脱苦率。所以,初步选择超声温度为50 ℃。

2.1.4 超声功率对柚皮脱苦率的影响 如图4所示,随超声功率增加,超声机械效应增强,柚皮细胞破坏程度增大,柚皮苷溶出率增加。当功率达到120 W时,脱苦率变化较为缓慢,能耗增加,综合考虑,选择超声功率为120 W。

图4 超声功率对柚皮脱苦率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic power on removal rate of naringin

2.1.5 超声波辅助碱液法正交实验 在单因素实验的基础上,采用L9(34)进行正交实验,其结果如表3所示。正交实验结果和极差R分析表明,影响柚皮脱苦率的主次因素依次是料液比(A)>超声时间(B)>超声功率(D)>超声温度(C)。由K值优选超声波脱苦最佳工艺条件为A2B3C3D2,即料液比1∶30 (g/mL),超声时间20 min,超声温度55 ℃,超声功率120 W,所得柚皮脱苦率为75.31%。

表3 超声波正交实验结果Table 3 Experimental results for the optimization of ultrasonic pretreatment

2.2 柚苷酶酶解法脱苦工艺条件优化

2.2.1 柚苷酶添加量对柚皮脱苦率的影响 由图5可知,柚苷酶添加量在0.05%～0.15%范围内,随着柚苷酶含量的增加,柚皮脱苦率显著增大,当添加量达到0.15%时,随着添加量的进一步增加,柚皮脱苦率变化趋于平缓,说明柚苷酶在0.15%时已经接近饱和,再增加柚苷酶含量,对柚皮苷含量影响不大,所以从经济的角度出发,选择0.15%的柚苷酶添加量。

图5 柚苷酶添加量对柚皮脱苦率的影响Fig.5 Effect of naringinase concentration on removal rate of naringin

2.2.2 酶解温度对柚皮脱苦率的影响 由图6可知,随着温度的升高,柚皮脱苦率明显升高,50 ℃时脱苦率达到最高值,随着温度的进一步升高,脱苦率呈现下降的趋势。这是由柚苷酶本身蛋白质的特性决定的,温度过高时,会降低柚苷酶的活性,导致脱苦率降低。所以选择柚苷酶最适酶解温度为50 ℃。

图6 酶解温度对柚皮脱苦率的影响Fig.6 Effect of enzymatic temperature on removal rate of naringin

2.2.3 酶解pH对柚皮脱苦率的影响 如图7所示,随着酶解pH的增加,柚皮脱苦率呈现增大的趋势,当pH为4.0时,脱苦率达到最大值,随着pH的进一步增加,脱苦率开始降低。这是因为pH的变化改变了柚苷酶的空间构象而活性降低,从而导致脱苦率下降。所以选择柚苷酶最适酶解pH为4.0。

图7 酶解pH对柚皮脱苦率的影响Fig.7 Effect of enzymatic pH on removal rate of naringin

2.2.4 酶解时间对柚皮脱苦率的影响 如图8所示,随着酶解时间的增加,柚皮脱苦率逐渐升高,40 min时达到最大值,在此之后,随着时间的延长,脱苦率升高缓慢,说明已经基本酶解完全,所以选择最佳酶解时间为40 min。

图8 酶解时间对柚皮脱苦率的影响Fig.8 Effect of enzymatic time on removal rate of naringin

2.2.5 柚苷酶脱苦法响应面优化实验

2.2.5.1 实验设计及结果 根据Box-Behnken的中心组合实验设计原理,综合单因素实验结果,选取柚苷酶添加量(X1)、酶解pH(X2)、酶解温度(X3)和酶解时间(X4)四个因素,采用四因素三水平的响应面分析方法,以柚皮脱苦率为响应值(Y),共29个实验点,其中24个为析因点,5个为中心点重复实验,以估计误差。实验设计及结果如表4所示。

表4 响应面优化实验Box-Behnken设计及结果Table 4 Box-Behnken design arrangement and experimental results

表5 方差分析Table 5 Variance analysis for the yield of naringin with various conditions

注:**p<0.01极显著;*p<0.05显著。2.2.5.2 回归模型建立及方差分析 运用Design-expert8.0软件对表4实验结果进行多元回归拟合,建立二次多项式回归模型。以柚皮脱苦率(Y)为目标函数的回归方程为:

Y=-232.08167-356.33333X1+7.59167X2+64.55667X3+1.095X4+6X1X2+80X1X3+0.21X2X3-0.022X2X4+0.44X3X4-918.66667X12-0.083967X22-11.89667X32-0.029967X42

由表5回归方程系数显著性检验可知,柚苷酶酶解脱苦法的工艺参数中,影响脱苦率的因素按主次顺序排列:酶解时间(X4)>酶解温度(X2)>酶添加量(X1)>酶解pH(X3),其中一次项X2和X4达到极显著水平(p<0.01),X1为显著水平;二次项X22、X32为极显著水平(p<0.01),其余项均不显著。

根据所得回归方程计算出最优工艺条件为:酶添加量0.15%、酶解温度51.93 ℃、酶解pH4.13、酶解时间35.64 min,在此条件下,柚皮最大脱苦率为92.77%。

2.2.5.3 验证实验 根据响应面法Box-Benhnken中心组合实验优化的工艺条件进行验证实验,考虑到实际操作的便利,将最佳工艺条件修正为酶添加量0.15%、酶解温度52 ℃、酶解pH4.1、酶解时间36 min,在此条件下进行3次平行实验,得柚皮平均脱苦率为90.14%,而回归方程所得的柚皮脱苦率理论预测值为92.77%,两者相对误差为2.83%,说明运用响应面法优化得到的模型参数是可靠得,能真实地反映各因素对柚皮脱苦率的影响。

2.3 超声波辅助碱液-酶解法与传统柚苷酶脱苦法比较研究

参考前人关于柚苷酶酶解的实验研究成果,并在本实验的基础上,设置传统柚苷酶酶解法的工艺参数为:酶添加量为0.15%、酶解温度52 ℃、酶解pH4.1,酶解时间为80 min,并与超声波辅助碱液-酶解法进行脱苦比较,其结果如图9所示。由图可知,酶解80 min后的柚皮,其脱苦率为71.65%,要小于超声波辅助碱液-酶解法的脱苦率90.14%。实验表明超声波辅助碱液-酶解法在柚皮脱苦中的应用,可以显著提高柚皮的脱苦率,比传统的单一柚苷酶酶解法脱苦效果更好。

图9 不同脱苦方法比较Fig.9 Comparison of different debittering methods

3 结论

通过单因素和正交实验确定超声波辅助碱液脱苦法的优化工艺条件为:料液比1∶30 (g/mL),超声时间20 min,超声温度55 ℃,超声功率120 W,所得柚皮脱苦率为75.31%。在此基础上,通过响应面优化实验进行柚苷酶酶解处理,其优化工艺条件为:酶添加量0.15%,酶解温度52 ℃,酶解pH4.1,酶解时间36 min,柚皮脱苦率为90.14%。超声波辅助碱液-酶解法与传统柚苷酶酶解法相比,显著提高了柚皮脱苦率,缩短了反应时间,有利于柚皮产品的深加工。

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Study on effect of debittering shaddock peelby ultrasound-assisted alkaline solution-enzymolysis method

LOU Xiao-yu,TONG Qun-yi*

(School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214112,China)

The ultrasound-assisted alkaline solution-enzymolysis method,which used removal rate of naringin as the index,was studied to get better debittering effect in the further-processing product of shaddock peel. By single factor experiment and orthogonal experiment,the results showed that the optimum treatment conditions of ultrasound-assisted alkaline solution were obtained as follows:material-to-liquid ratio 1∶30 (g/mL),ultrasonic treatment time 20 min,ultrasonic temperature 55 ℃,ultrasonic power 120 W. Under these optimum conditions,the removal rate of naringin was 75.31%.On this basis,by response surface design,the results showed that 90.14% removal rate of naringin was achieved through the use of naringinase at 0.15%,dosage for 36 min,pH4.1 and 52 ℃. The results of this study indicated that the ultrasound-assisted alkaline solution-enzymolysis method was more effective compared with the traditional naringinase enzymolysis method.

ultrasound;naringinase;shaddock peel;debittering

2016-12-23

娄潇雨(1991-)，女，硕士研究生，研究方向：碳水化合物，E-mail:lxy910428@126.com。

*通讯作者:童群义(1963-)，男，博士，教授，研究方向：碳水化合物，E-mail:tqyjn@163.com。

TS255.1

B

1002-0306(2017)13-0206-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.13.039