曾 俊,杨瑞山,蔡晓洋,周海玉,黄 珍,王 盼,李 敏

(成都中医药大学中药材标准化教育部重点实验室中药资源系统研究与开发利用国家重点实验室,四川成都 611137)



俄色叶提取物对小鼠急性酒精性肝损伤的保护作用

曾 俊,杨瑞山,蔡晓洋,周海玉,黄 珍,王 盼,李 敏*

(成都中医药大学中药材标准化教育部重点实验室中药资源系统研究与开发利用国家重点实验室,四川成都 611137)

目的:研究俄色叶提取物对小鼠酒精性肝损伤的保护作用。方法:采用体积分数为50%的乙醇一次性灌胃造成小鼠急性肝损伤,检测各组小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)的水平,及肝组织匀浆中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)水平的变化,同时HE染色观察肝脏组织学改变。结果:俄色叶提取物能不同程度地降低小鼠血清中ALT、AST、TG、LDL-C水平,减少肝匀浆MDA含量,升高肝匀浆SOD、GSH-Px的活性。病理切片显示各给药组小鼠肝组织损伤均有不同程度的减轻。结论:俄色叶提取物对小鼠急性酒精性肝损伤有一定的保护作用。

藏药,俄色叶,酒精性肝损伤,保护作用

酒精性肝病(ALD)是世界范围内导致急慢性肝病的主要原因[1],ALD及其并发症也是最常见的死因之一[2]。酒精的滥用和依赖导致的ALD病谱包括脂肪肝、酒精性肝炎、肝纤维化和肝硬化,甚至可发展至肝癌。ALD发病机制复杂,首先肝脏是机体乙醇代谢的主要场所,在乙醇代谢过程中,产生氧化应激损伤肝脏,氧化应激损伤有可能诱发脂质过氧化,进一步损伤肝脏;氧化应激亦可能引起肝细胞凋亡与再生,长期饮酒不仅会导致肝细胞凋亡,还可抑制患者的肝细胞增殖,导致ALD发生发展[3]。随着现代人们生活方式的变化,ALD对人类健康产生了严重的威胁,但目前尚无FDA 批准的有效药物疗法。而大量非传统药物也有可能被证明为有效药物,因此开发安全有效的能够预防ALD的食品或保健品意义重大[4]。

“俄色叶”来源于蔷薇科苹果属植物变叶海棠Malustoringoides(Rehd.)Hughes.和花叶海棠Malustransitoria(Batal.)Schneid. 的干燥叶及叶芽[5]。在甘孜州藏区,俄色叶虽为藏族民间习用药材,但俄色叶的食用历史较长,其食品标准已在四川省卫生厅备案。近年来俄色叶在食品、保健食品及药品方面的使用量逐年增加,炉霍县林业局已将其开发成保健茶“雪域俄色茶”,并已成为国家地理标志性产品。主要有攻坚化积、除腻涤滞、保肝利胆等功效,主治消化不良、高血压、高血糖、高血脂及一些肝脏疾病[6-7]。现代研究表明俄色叶对CCl4引起的小鼠急性肝损伤具有很好的保护作用[8],其果实“俄色果”对急性酒精性肝损伤有一定的保护作用[9]。目前主要将俄色叶应用于降血压、降血脂和降血糖等方面,对于保肝方面的研究较少。本实验建立小鼠急性酒精性肝损伤的模型,通过观察给予俄色叶提取物后小鼠生化、病理的改变,探讨俄色叶提取物对小鼠急性酒精性肝损伤有无保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

雄性昆明种小鼠 117只,体重(22±2) g,由成都达硕实验动物有限公司提供,动物质量合格证号:SCXK(川)2013-24；俄色叶 四川省炉霍县雪域俄色有限公司提供,经成都中医药大学中药鉴定教研室李敏教授鉴定为蔷薇科苹果属植物变叶海棠Malustoringoides(Rehd.)Hughes或花叶海棠Malustransitoria(Batal.)Schneid的干燥叶及叶芽;联苯双酯滴丸(DDB) 浙江万邦药业股份有限公司,批号:A02140302;低密度脂蛋白(LDL-C)、甘油三酯(TG)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)检测试剂盒 南京建成工程研究所,批号分别为:20150420、20150420、20150521、20150417;丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)检测试剂盒 Abcam公司,批号分别为:Rm0739XL、Rm1377XL、Rm0149XL。

Mk3多功能酶标仪 美国赛默飞世尔仪器有限公司;DZKW-4电子恒温水浴锅 北京中兴伟业仪器有限公司;X-22R冷冻离心机 美国Beckman Coulter公司;图像分析软件Motic Images Advanced。

1.2 实验方法

1.2.1 受试样品的制备 称取花叶海棠叶、变叶海棠叶干燥粉末(过三号筛),加入20倍体积蒸馏水,加热回流提取2 h,纱布虑过,重复提取3次,合并滤液,浓缩成含生药0.5 g/mL的药液,生理盐水溶解,得到不同浓度的提取液。

1.2.2 动物分组、给药与模型制备 将117只雄性小鼠适应性喂养4 d后随机分为9组,每组13只:正常对照组,模型组,阳性对照组(DDB组,150 mg/kg),花叶海棠、变叶海棠各剂量组(0.6、1.2、2.4 g/kg)。受试样品用生理盐水配制,各组小鼠按0.2 mL/10 g体重灌胃容量来计算,正常对照组和模型组灌胃等体积生理盐水,按顺序每天灌胃一次受试样品,连续30 d,灌胃后自由饮食。实验至第31 d,除正常对照组给予等体积蒸馏水外,阳性对照组、实验组及模型组以12 mL/kg的量,用50%体积分数的乙醇溶液按顺序灌胃,建立小鼠急性肝损伤模型。

1.2.3 一般情况观察 实验期间观察小鼠的精神状态、行为、毛发光泽度及死亡等情况,并记录进食量和饮水情况。

1.2.4 指标测定 末次灌胃后,小鼠禁食不禁水16 h,去除死亡小鼠,按原先给药顺序各组取8只小鼠摘眼球采血,分离血浆,取血清,按照试剂盒说明书分别测定血清中的ALT、AST、TG和LDL-C水平;准确称取肝脏相同部位0.2 g,以1∶9(m/V)的生理盐水制成肝匀浆,按照试剂盒说明书分别测定肝组织中MDA、SOD和GSH-Px水平。

1.2.5 肝脏病理组织学检查 取小鼠肝脏左叶,4 ℃生理盐水冲尽残血,滤纸拭干,4%多聚甲醛固定液固定,石蜡包埋切片,苏木素-伊红(HE)染色,光镜下观察肝组织切片的病理形态学变化。

2 结果与分析

2.1 一般情况观察及死亡率

给予50%的乙醇染毒后,小鼠多先表现出兴奋状态,继而行走不稳,四肢瘫软,重者嗜睡、醉倒、呼吸急促、抽搐,此状态持续2 h左右。12 h后观察死亡情况,死亡率结果见表1。由表1可知,各给药组均能明显降低乙醇染毒后小鼠的死亡率。结果表明俄色叶提取物具有良好的保肝作用。

表1 俄色叶提取物对急性酒精性肝 损伤小鼠死亡率的影响(n=13)Table 1 Effects of Eseye extracts on mortality of mice with acute alcoholic liver damage(n=13)

2.2 对急性酒精性肝损伤小鼠血清中ALT、AST、TG、LDL-C水平的影响

与正常对照组相比,模型组小鼠的ALT、AST、TG、LDL-C均显著升高(p<0.01)。与模型组相比,除花叶海棠高剂量组小鼠的AST和变叶海棠低剂量组小鼠的TG无显著差异外,其余各给药组血清中ALT、AST、TG、LDL-C均显著降低(p<0.05或p<0.01)。见表2。

表2 俄色叶提取物对急性酒精性肝损伤小鼠血清中 ALT、AST、TG、LDL-C 水平的影响Table 2 Effects of Eseye extracts on the level of ALT,AST,TG,LDL-C in mice serum with acute alcoholic liver ±s,n=8)

注:与正常对照组比较:**p<0.01,*p<0.05;与模型组比较:##p<0.01,#p<0.05。

表3 俄色叶提取物对急性酒精性肝损伤小鼠肝匀浆中MDA、SOD、GSH-Px水平的影响±s,n=8)Table 3 Effects of Eseye extracts on the level of MDA,SOD,GSH-Px in mice liver homogenate with acute alcoholic liver ±s,n=8)

注:与正常对照组比较:**p<0.01,*p<0.05;与模型组比较:##p<0.01,#p<0.05。2.3 对急性酒精性肝损伤小鼠肝匀浆中MDA、SOD、GSH-Px水平的影响

与正常对照组相比,模型组小鼠的MDA含量显著升高(p<0.01),SOD、GSH-Px活性显著降低(p<0.01);与模型组相比,花叶海棠低剂量组对MDA含量影响不显著,变叶海棠低剂量组对SOD活性影响不显著,花叶海棠高剂量组对GSH-Px活性影响不显著,其余各给药组MDA含量显著降低(p<0.05或p<0.01),SOD、GSH-Px活性显著升高(p<0.05或p<0.01)。见表3。

2.4 对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏组织病理学的影响

由图1可得光镜下观察各组小鼠肝组织切片,正常对照组肝小叶结构完整、清晰,肝细胞索放射状排列,肝细胞核清晰、胞质均匀,未见增生及假小叶形成,肝细胞未见变性、坏死,及各类细胞浸润;模型组小鼠大部分肝小叶结构基本完整,但肝细胞出现中重度水肿变性,肝细胞间隙不清,胞浆淡染、偶见细胞坏死,肝窦间及汇管区周围可见炎细胞浸润,未见脂肪变性。DDB组和俄色叶提取物各剂量组小鼠肝细胞索放射状排列,肝细胞正常,无明显变性,肝细胞胞浆着色较均匀,细胞核结构清晰。其中俄色叶提取物各组偶见少许细胞水肿及炎细胞浸润(图1D-1、D-3、E-1),未见脂肪变性。病理图片见图1。

图1 俄色叶提取物对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏组织病理学影响(HE,×100)Fig.1 Effects of Eseye extracts on Histopathological of liver in mice with acute alcoholic liver damage(HE,×100)

3 讨论

乙醇诱导小鼠急性肝损伤实验结果表明:模型组小鼠血清ALT、AST、TG、HDL-C显著升高,肝组织SOD、GSH-Px活性显著降低,MDA含量显著升高,病理切片观察到肝组织细胞中重度水肿变性、可见少许炎性细胞浸润,偶见细胞坏死,说明乙醇在代谢中对肝细胞产生了脂质过氧化、对肝细胞膜、细胞微粒体的损害作用,并导致肝功能、血脂的异常。而提取物各剂量组均能明显降低血清中ALT、LDL-C水平,能不同程度降低AST、TG;同时能不同程度降低肝组织中MDA,不同程度增加SOD、GSH-Px活性,减少病理组织切片中细胞的水肿、炎性细胞的产生和细胞坏死,表明俄色叶提取物具有一定的保护肝脏的作用。俄色叶提取物中主要含黄酮类成分,其中含量最高的成分为根皮苷[17-18]。冯天艳[19]等研究表明,根皮苷对CCl4致小鼠急性肝损伤具有明显保护作用。

4 结论

俄色叶提取物对酒精性急性肝损伤有一定的保护作用,其作用机制可能是通过调节肝功能、清除自由基、抑制脂质过氧化以及增强抗氧化能力来完成的,该机制有待进一步研究。俄色叶中含有多糖类、鞣质类、黄酮类等多种化学成分,其中黄酮类化合物含量最大并具有抗氧化活性,且根皮苷已被发现具有保肝作用,但其他成分是否具有保肝作用,需要进一步研究。

[1]常彬霞,孙颖,滕光菊,等. 2012年欧洲肝病学会及2010年美国肝病学会关于酒精性肝病指南的解读[J]. 临床肝胆病杂志,2015(1):30.

[2]TILG H,DAY C P. Management strategies in alcoholic liver disease[J]. Nature Clinical Practice Gastroenterology & Hepatology,2007,4(1):24-34.

[3]邱萍,李相,孔德松,等. 酒精性肝病发病机制研究的新进展[J]. 中国药理学通报,2014,30(2):160-163.

[4]朱慧艳,李婷冶,陈洁. 酒精性肝病的诊断和治疗进展[J].医学综述,2014,20(14):2556-2559.

[5]王道清,李敏,石万银.藏药“俄色”的资源调查及生药学研究[J].中药与临床,2011(3):14-16.

[6]晶镜本草[M]. 北京:民族出版社,1995:551-553.

[7]四川省藏药材标准[M]. 成都:四川科学技术出版社,2014.

[8]夏冬梅.俄色叶的质量标准研究[D].成都：成都中医药大学,2014.

[9]周海玉,李敏,蔡晓洋,等. 藏药俄色果对急性酒精性肝损伤小鼠的保护作用及其机制初探[J]. 中药材,2016,39(1):193-196.

[10]陈惠军. 酒精性肝病的回顾性研究[D]. 广州：广州中医药大学,2009.

[11]李南珠. 乙醇在肝脏中的代谢与乙醇性肝损伤[J]. 中国现代医药杂志,2008,10(3):128-129.

[12]赵敏,池莉平,王凤岩,等. 小鼠急性酒精性肝损伤模型的建立及应用[J]. 华南预防医学,2005,31(1):14-17.

[13]谢大伟,刘翠香,王炳元,等. 酒精性脂肪性肝病与非酒精性脂肪性肝病的血液生化学检查特点[J]. 世界华人消化杂志,2010(25):2654-2659.

[14]李有贵. 竹节人参皂苷对乙醇性肝损伤的保护机理研究[D]. 杭州：浙江大学,2011.

[15]李爱华,赵刚. 酒精性肝病发病机制的研究进展[J]. 吉林医学,2010,31(17):2670-2672.

[16]屈胜胜. 巴西莓对酒精性肝损伤的保护作用及机制研究[D]. 北京：北京中医药大学,2014.

[17]夏冬梅,李敏,王道清,等. 藏药俄色叶中根皮苷,根皮素含量分析[J]. 中国现代中药,2014(8):618-622.

[18]温馨,田甜,沈悦,等. 超声波辅助提取变叶海棠中总黄酮工艺优化及抗氧化活性研究[J]. 天然产物研究与开发,2016(3):452-456,461.

[19]冯天艳,方荣,邓改改,等. 根皮苷对小鼠 CCl4 急性肝损伤的保护作用[J]. 中药药理与临床,2010,26(5):47-50.

Hepatoprotective effects of Eseye extracton acute alcoholic liver damage in mice

ZENG Jun,YANG Rui-shan,CAI Xiao-yang,ZHOU Hai-yu,HUANG Zhen,WANG Pan,LI Min*

(Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,The Ministry of Education Key Laboratory for Standardization ofChinese Medicines,State Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research Development and Utilization of ChineseMedicines Resources Co-founded by Sichuan Province and Ministry of Science and Technology,Chengdu 611137,China)

Objective:To investigate the hepatoprotective effects of Eseye extracts against alcohol-induced acute liver injury in mice. Method:The acute liver injury animal model was established in mice by alcohol gavage(50%). The serum levels of ALT,AST,LDL-C and TG were determined. MDA,SOD and GSH-Px were detected in the liver homogenate,as well as the histopathological changes of the liver were observed by HE staining. Result:Eseye extract decreased the levels of ALT,AST,TG and LDL-C in serum. Meanwhile,the MDA content in liver homogenate was reduced whereas the activity of SOD and GSH-Px were increased by Eseye extract. According to the liver histopathological observation,all of treatment groups showed alleviation in mice liver injury to varying degrees. Conclusion:Eseye extract has protective effects on acute liver injury induced by alcohol in mice.

Tibetan medicine;Eseye;alcoholic liver injury;preventive effect

2016-12-06

曾俊(1992-),女,硕士研究生,研究方向:中药品种、质量与资源研究,E-mail:z_zengj@163.com。

*通讯作者:李敏(1962-),女,本科,教授,研究方向:中药品种、质量及资源研究,E-mail:028limin@163.com。

全国第四次中药资源普查(2012-H-100)。

TS201.4

A

1002-0306(2017)13-0311-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.13.058