杨 晖,马 良,韩 霜,黄丹丹,张宇昊,2,*

(1.西南大学食品科学学院,重庆 400715;2.西南大学 国家食品科学与工程实验教学中心,重庆 400715)



明胶添加量对兔皮明胶膜特性与结构的影响

杨 晖1,马 良1,韩 霜1,黄丹丹1,张宇昊1,2,*

(1.西南大学食品科学学院,重庆 400715;2.西南大学 国家食品科学与工程实验教学中心,重庆 400715)

从兔皮中提取明胶制备明胶膜,通过测定不同明胶添加量下膜的机械性能、水蒸气透过率、亚基组成和结构,探究明胶添加量对明胶膜特性与结构的影响。结果表明随着明胶添加量的增加,明胶膜体系内网络空间结构变大,从而膜的厚度增加。力学结果显示,明胶添加量为4 g/100 mL(w/v)时,明胶膜抗拉强度最高(p<0.05);明胶添加量为6 g/100 mL(w/v)时,明胶膜断裂伸长率最低(p<0.05)。水蒸气透过率结果表明随着明胶添加量的增加,水蒸气透过率呈现上升趋势。凝胶电泳结果显示,明胶添加量为4 g/100 mL(w/v)时,低分子量的蛋白组分产生更多交联,形成蛋白质-蛋白质交联的结构,此浓度下明胶膜的抗拉强度最大。FT-IR分析表明:当明胶添加量增加至4 g/100 mL(w/v)时,酰胺A带向高波数移动,说明肽链上的N-H基团并没有与甘油的-OH基团相互反应,而是明胶分子的官能团之间产生更强的相互作用,形成独特的网络结构。同时,酰胺Ⅰ带曲线拟合结果也表明当明胶添加量为4 g/100 mL时,膜内稳定结构较多,明胶分子之间的相互反应达到最大化,明胶膜的稳定性和成膜性能较优。

兔皮,明胶膜,明胶添加量,结构

在食品包装领域,塑料制品因具有低成本性、轻便性和阻气性等优点而被广泛使用[1],但是它缺少回收性,不具备可再生性和生物降解性。天然的生物高分子具有良好的生物相容性和可降解性,越来越多地被应用到制造生物可降解膜中[2]代替部分传统包装材料。在天然生物高分子中,蛋白质分子相对于多糖,其通过共价键相互作用的结合力更强,有助于提高膜的力学特性。而在蛋白质中,明胶来源广泛、价格低廉,具有良好的成膜能力和功能应用特性,适用于制备生物可降解包装。

明胶是胶原在酸、碱、酶或高温作用下的变性产物[3]。目前国内外对于明胶膜的研究主要以水产明胶为主,通常是水产品加工副产物,例如鱼的皮、骨、鳞等[4-6]。但是水产明胶膜存在抗拉强度较低和水溶性较高的缺陷[5],一定程度上限制了其在食品包装中的实际应用,而哺乳动物明胶膜能较好的克服这些缺点,例如Avena[6]等人研究发现哺乳动物明胶膜的抗拉强度和断裂伸长率比深海鱼明胶膜的更大,即膜的机械性能更优;Hanani[7]对猪、牛、鱼明胶膜进行对比,发现猪明胶膜的抗拉强度最大且水溶性最低。但是传统的哺乳动物明胶通常来源于猪、牛的皮和骨,此类明胶原料由于疯牛病、口蹄疫等安全问题和宗教信仰问题被限制使用。近年来我国兔肉加工产业发展迅速,兔皮作为主要的加工副产物丢弃会造成浪费和对环境的污染,若从兔皮中提取明胶,试图以兔皮明胶代替传统哺乳动物明胶,不仅能提高兔皮的利用率、延长兔肉加工产业链,还能克服水产明胶膜在抗拉强度和水蒸气透过率方面存在的缺陷以及传统哺乳动物明胶存在的安全问题。

有学者研究表明明胶添加量会对明胶膜的特性与结构产生显著性影响,例如Acosta[8]发现不同明胶-淀粉比例的共混膜在机械性能和水蒸气透过率方面存在差异;Hosseini[9]等人研究发现明胶添量对水蒸气透过率和力学性能有显著影响;刘莉莉[10]研究发现明胶添加量会影响复合膜的透光率、水溶性和结晶度。综上,本文以兔皮明胶为原料制备明胶膜,通过测定抗拉强度、断裂伸长率、水蒸气透过率等指标探究明胶添加量对明胶膜特性的影响,同时通过红外光谱、SDS-PAGE凝胶电泳研究明胶膜微观结构的变化。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

兔皮 购于重庆阿兴记食品有限公司,原料获取后洗净冻藏于-20 ℃冰箱中备用。

盐酸、氯化钠、硫化钠、氢氧化钙、硅藻土 成都市科龙化工试剂厂出品;甘油 生工生物工程(上海)有限公司生产;过硫酸铵(APS)、十二烷基硫酸钠(SDS)、Tris、β-巯基乙醇(2-ME)、四甲基乙二胺(TEMED)、考马斯亮蓝R-250 BIO BASIC公司出品;质量分数为30%丙烯酰胺(丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺质量比为29∶1) 北京索莱宝科技有限公司出品。其中Tris、考马斯亮蓝R-250、30%丙烯酰胺为优级纯,其他试剂均为分析纯。

JA3003B电子天平 上海精天电子仪器有限公司;PHS-25 型数显酸度计 杭州雷磁分析仪器厂;DGG-9140A电热恒温鼓风干燥箱 上海齐欣科学仪器有限公司;8002 型温控水浴锅 北京永光明医疗仪器厂;CJ-78-1磁力搅拌器 上海将任实验设备有限公司;Spectrun100红外光谱仪 美国PerkinElmer公司;Power PacTM基础电泳仪 美国Bio-Rad公司;G:BOX EF型凝胶成像系统 英国Syngene公司;紫外—可见光分光光度计752 上海菁华科技仪器有限公司;智能电子拉力机XLW-PC型 济南兰光机电技术有限公司;PERMA W3/060型水蒸气透过率测试仪 济南兰光机电技术有限公司;数显测厚规,上海川陆量具有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 兔皮明胶的提取 兔皮明胶提取方法在于玮[11]等报道的基础上,稍加改动。具体提取工艺流程如下:

新鲜兔皮→清洗、去除皮下脂肪→脱毛→清洗、剪切→除杂蛋白→清洗→稀酸处理→提胶→过滤→热风干燥→成品明胶

为了提高明胶纯度,在提胶过程中,向提胶料液中加入体积比为1∶50(硅藻土溶液:提胶液)的6%硅藻土溶液,随后用孔径为1.2 μm的微滤膜真空过滤。

1.2.2 明胶膜的制备 分别称取3.0、4.0、5.0、6.0 g兔皮明胶置于200 mL烧杯中并加入0.88 g甘油(以4.0 g明胶质量的22%计)和100 mL去离子水,室温下溶胀2 h,60 ℃水浴加热并间断搅拌,使明胶完全溶解,形成均匀的液体,40 W超声10 min,除去气泡,制得明胶成膜溶液(film-forming solutions,FFS)。量取30 mL成膜溶液均匀平铺于130 mm×130 mm的塑料培养皿上,在温度(45±1) ℃下干燥24 h,揭下的膜置于干燥皿中平衡48 h后,作为待测样品。

1.2.3 厚度的测定 用测厚规在膜上随机选取个10点,测定其厚度并计算平均值和标准差。

1.2.4 机械性能的测定 将膜剪切成50 mm×15 mm的矩形长条,用智能电子拉力机测定膜的抗拉强度和断裂伸长率。

参数设置:速度50 mm/min,夹具间距15 mm,测试温度25 ℃,相对湿度65%。

每个样品测定三次,求取平均值。

1.2.5 水蒸气透过率(WVP)的测定 用水蒸气透过率测试仪测定膜的水蒸气透过率。

参数设置:时间间隔20 min,测试温度25 ℃,相对湿度70%。

每个样品测定三次,求取平均值。

水蒸气透过率计算公式[12]:

式中:Δm-t时间内的质量增量,g;d-试样厚度,cm;A-试样透水蒸气的面积,cm2;t-质量变化稳定后的两次间隔时间,s;ΔP-试样两侧的水蒸气压差,Pa。

1.2.6 红外光谱分析 称取一定量样品与溴化钾(KBr)混合研磨,于45 ℃下烘干后压片,用Spectrun100红外光谱仪进行检测。室内温度为25 ℃,扫描范围:450～4000 cm-1,扫描次数:32,分辨率4 cm-1。对1700～1600 cm-1波数的图谱采用origin8.6数据处理软件进行基线校正、去卷积和做二阶导数图谱,再自动拟合直至残差最小,得到子峰图谱(各子峰峰位及峰面积),最后根据积分面积计算对应二级结构的含量。

1.2.7 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析 称取10 mg明胶膜溶解于1 mL蛋白变性剂[13]中,室温振荡24 h,离心取上清液,双缩脲法测定上清液蛋白浓度[14],并将蛋白浓度稀释到2 mg/mL,按体积比4∶1添加5×样品缓冲液,沸水浴5 min,冷却后上样,上样量为15 μL(Marker上样量为10 μL),其中分离胶和浓缩胶的质量分数分别为6%和4%。15 mA恒流电泳,待溴酚蓝跑到分离胶中后,电流调至25 mA。电泳结束后用考马斯亮蓝R-250进行染色,2 h后用脱色液于40 ℃下振荡脱色1 h。背景蓝色脱净后用凝胶成像系统拍摄电泳图谱,用Gene Tools数据处理软件进行分析。

1.2.8 数据分析 每次实验设置三个平行实验,数据以平均值±标准偏差表示,并用统计软件SPSS 17.0 进行显著性分析(Tukey;p<0.05),用origin8.6作图。

2 结果与分析

2.1 明胶添加量对膜厚度的影响

表1 不同明胶添加量下膜的厚度Table 1 Thickness of films with different gelatin additions

表2 不同明胶添加量下膜的力学性质Table 2 Mechanical properties of films with different gelatin additions

注:采用Tukey方法分析,字母a、b、c(同一行不同字母)表示显著性差异(p<0.05,n=3)。由表1可知,随着明胶添加量的增加,膜的厚度从54.3 μm逐渐增加到92.7 μm,这是因为明胶分子间通过氢键相互反应形成网络结构,随着明胶体系内明胶含量增加,网络空间结构变大,膜内体积增加,从而膜的厚度逐渐增加。

2.2 明胶添加量对膜力学性能的影响

由表2可知,随着逐渐明胶添加量的增加,明胶膜的抗拉强度呈现先升高后降低的趋势,而断裂伸长率呈现持续降低的趋势。相对于明胶添加量为3、5、6 g/100 mL的明胶膜而言,4 g/100 mL的明胶添加量对明胶膜的抗拉强度产生显著性影响(p<0.05);明胶添加量为5 g/100 mL时,断裂伸长率显著降低至1.08%(p<0.05),且即使提高明胶添加量至6 g/100 mL,断裂伸长率仍在1.05%左右。

明胶添加量为3 g/100 mL时,明胶体系内明胶含量较低,因而明胶分子间相互作用降低,明胶膜网络结构中明胶分子主要与甘油相互作用,膜的刚性结构被软化,导致明胶膜断裂伸长率较大,抗拉强度较低。随着明胶添加量提高至4 g/100 mL,明胶分子与甘油相互作用的比例降低,绝大部分明胶分子通过水分子形成氢键相互作用,分子间作用力增强,因而明胶膜的脆性增加,抗拉强度和断裂伸长率分别呈现升高和降低的趋势。但是当明胶添加量增至5 g/100 mL时,抗拉强度呈现降低的趋势可能由于明胶膜内所形成的三维蛋白网络结构已经达到极限,致密的结构导致分子间流动性降低[6]。

2.3 明胶添加量对膜水蒸气透过率的影响

Hanani等人[15]研究发现厚度是影响明胶膜水蒸气透过率的重要因素:随着厚度增加,水蒸气透过明胶膜时受到的阻力增加,使膜内表面的平衡水蒸气分压增加,水蒸气透过率会降低。但是由图1可知,随着明胶添加量的提高,明胶膜的水蒸气透过率呈现逐渐增加的趋势。一方面因为明胶分子具有亲水性,能与水分子通过氢键相互反应[16],所以随着明胶含量增加,膜内水分子的吸附性增强,从而水蒸气透过率增加;另一方面由水蒸气透过率公式可得,水蒸气透过率值与厚度呈正相关,即厚度越大水蒸气透过率值越大。

图1 明胶添加量对明胶膜水蒸气透过率的影响Fig.1 The effect of different gelatin additions on the water vapor permeabilities of gelatin films

2.4 SDS-PAGE分析

不同明胶添加量下明胶膜各亚基组成如图2所示,主要得到分子量分别为209、122、112 kDa的三条条带,对应于蛋白的α1、α2链以及β组分[17],说明明胶膜蛋白组分主要由两条α链(α1和α2)和β组分(二聚物)组成。Hoque等人[18]研究发现明胶蛋白组分的降解可能会导致较低的抗拉强度,由图2可知,当明胶添加量为4 g/100 mL时,α1链和α2链谱带强度最强,而当明胶添加量为3 g/100 mL和5 g/100 mL时明胶膜的条带颜色较4 g/100 mL浅,可能是因为两条α链存在部分降解,同时此条件下明胶膜的抗拉强度也显著低于明胶添加量为4 g/100 mL的明胶膜(p<0.05),与Hoque[16]所报道的趋势一致。

图2 明胶添加量对明胶膜蛋白组分的影响Fig.2 The effect of different gelatin additions on the protein patterns of gelatin films注：M:标准蛋白;1:明胶添加量3 g/100 mL; 2:明胶添加量4 g/100 mL;3:明胶添加量5 g/100 mL。

2.5 FT-IR分析

不同明胶添加量下明胶膜的酰胺A带的吸收特征峰分别位于3400、3421、3419 cm-1处。酰胺A带主要表征N-H基团的伸缩振动,由图3可知,随着明胶添加量的提高,波数逐渐向高频率移动,说明当明胶添加量增至4 g/100 mL后,肽链上的N-H基团并没有与甘油的-OH基团相互反应,相反明胶分子的官能团之间产生了更加强烈的相互作用[11],形成独特的网络结构。酰胺B带吸收峰在2929、2928 cm-1左右,并无明显差异。1043 cm-1为甘油吸收特征峰[18]。明胶膜酰胺Ⅰ带的吸收峰分别位于1636.2、1636、1649 cm-1处,发现当明胶添加量为5 g/100 mL时,酰胺Ⅰ带显著增加。Doyle等人[19]研究发现酰胺Ⅰ带对蛋白质二级结构有明显影响,因此对红外光谱图1700～1600 cm-1范围进行去卷积和高斯拟合,分离出相应子峰。根据文献报道[20-22],将主要子峰峰位做如下归属:1630、1642、1652、1662 cm-1分别为β-折叠、无规则卷曲、α-螺旋和三螺旋结构。由表3可知,随着明胶添加量增加,膜内无规则卷曲含量逐渐降低,说明此时膜内结构改变,分子秩序有所升高[23]。明胶膜的特性与无规则卷曲和三螺旋结构含量有关,两者比值低说明膜内无序结构较少,表明膜稳定性能较优[24]。当明胶添量为4 g/100 mL时,两者的比例最低,说明此时膜内稳定结构较多,明胶分子之间的相互反应达到最大化,即明胶的稳定性和成膜性能较优。

图3 不同明胶添加量红外光谱图Fig.3 FTIR spectra of films with different gelatin additions 表 3 不同明胶添加量下明胶膜二级结构含量(%)Table 3 The secondary structured content of gelatin films at different gelatin additions(%)

明胶含量(g/100mL)345β-折叠3491210467无规则卷曲350414201758α-螺旋323754510三螺旋结构409546554

3 结论

结果表明,随着明胶添加量的提高,明胶膜的厚度和水蒸气透过率呈现上升的趋势。力学结果显示,当明胶添加量为4 g/100 mL时,明胶膜的抗拉强度产生最大;当明胶添加量为3 g/100 mL时,明胶膜的断裂伸长率最大。SDS-PAGE结果表明,当明胶添加量为4 g/100 mL时,明胶膜的谱带强度最大,说明明胶膜体系内的低分子量蛋白产生更多交联。FT-IR结果显示当明胶添加量增至4 g/100 mL时,酰胺A带向高波数移动,说明明胶基质中呈现更多明胶分子自身之间的相互反应,从而形成独特的网络结构。

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Effect of gelatin additions on the propertiesand structure of rabbit skin gelatin films

YANG Hui1,MA Liang1,HAN Shuang1,HUANG Dan-dan1,ZHANG Yu-hao1,2,*

(1.College of Food Science,Southwest University,Chongqing 400715,China;2.National Food Science and Engineering Experimental Teaching Center,Southwest University,Chongqing 400715,China)

The effect of gelatin additions on the properties and structure of rabbit skin gelatin films was studied by measuring the mechanical properties,water vapor permeabilities,subunit content and structure. The results showed that the thickness increased because gelatin network structure in the gelatin film system increased with increasing the addition of gelatin. Mechanical property results showed that the tensile strength of gelatin films was the highest when the addition of gelatin was 4 g/100 mL(w/v),however the gelatin films possessed the highest elongation at break as the addition of gelatin was 6 g/100 mL(w/v). The water vapor permeabilities of gelatin films increased with increasing the gelatin additions. The results of sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)indicated that the low molecular weight of protein fraction formed protein-protein cross-linking which resulted in the highest tensile strength as the gelatin addition was 4 g/100 mL(w/v). FT-IR results showed that amide A band moved to high wave number as the gelatin addition was 4 g/100 mL(w/v),which indicated that glycerol molecules didn’t react with N-H group of peptides. A greater interaction occurring between gelatin functional groups to form a unique network structure conversely. Furthermore,curve-fitting of amideⅠband showed that there were more stable structure in the film matrix as the gelatin addition was 4 g/100 mL(w/v),so the films possessed greater stability and film-forming properties.

rabbit skin;gelatin films;gelatin addition;structure

2016-12-27

杨晖(1991-),女,硕士研究生,研究方向：食品化学与营养，E-mail:365363469@qq.com。

*通讯作者:张宇昊(1978-),男,博士,教授,研究方向：蛋白和生物活性肽，E-mail:Zhy1203@163.cn。

国家自然科学基金-青年科学基金项目(31301425);中央高校基本科研业务费重大项目(XDJK2015A015);中国博士后科学基金面上项目(2014M562267);中国博士后科学基金特别资助项目(2015T80951);重庆市基础科学与前沿技术研究专项重点项目(cstc2015jcyjBX0116);第四批重庆市高等学校优秀人才支持计划项目。

TS201.1

A

1002-0306(2017)13-0220-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.13.042