金 丹,蒋艾廷,乔传丽,李宝坤

(石河子大学食品学院畜产实验室,新疆石河子 832000)



新疆酸马奶中乳酸菌的乙醇耐受性及蛋白酶性质研究

金 丹,蒋艾廷,乔传丽,李宝坤*

(石河子大学食品学院畜产实验室,新疆石河子 832000)

通过对新疆酸马奶中乳酸菌以传统方式分离鉴定后,筛选得到不同种属菌株,并进一步对其乙醇耐受性及蛋白酶活性差别进行研究。结果表明:在分离的21株菌株中,其不同种属的5株菌株在不同浓度乙醇胁迫12 h后,在耐胁迫能力上,由高到低分别为发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici),其中最高能够耐受浓度为13%的乙醇胁迫。对蛋白酶水解能力的测定结果表明，菌株均能产生蛋白酶,其中乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)的水解圈直径最大,为13.1 mm,其菌株自溶度为36.4%。菌株的乙醇耐受性与其蛋白酶水解能力间无显著关联性。

酸马奶,乳酸菌,乙醇,蛋白酶,自溶度

酸马奶(Koumiss)在新疆、内蒙等地区广受欢迎,其独特的营养保健功效一直被人们所重视[1]。它是经乳酸菌等多种微生物共同发酵而成的低酒精酸性乳饮料[2],酸马奶有一定的降低血液浓度的功效,并且能够在一定程度上改善血液循环,控制血液中血脂的含量[3],酸马奶中含有人体中所必需的金属离子、维生素及部分微量元素,其中维生素B5的含量比母乳中高出近20倍,维生素C的含量为牛乳的7倍,酸马奶的高营养价值和良好的医用价值与其中乳酸菌的作用密不可分[4]。

乳酸菌(Lacticacidbacteria,LAB)是一种原核,无孢子革兰氏阳性菌,它将一系列碳源主要发酵成乳酸[5],在食品工业生产中,LAB主要用于食品和饮料的发酵及胞外多糖的生产[6],其在食品工业生产中的广泛应用,主要是作为起始培养物用于许多产品的生产发酵[7]。然而,作为细胞工厂,乳酸菌在工业生产期间及人体的胃肠道中会遇到各类胁迫条件,如酸胁迫、冷胁迫、乙醇胁迫等[8]。通过胁迫作用将会导致菌体存活率或生长速率的降低,且会引起菌体内部基因、蛋白质或酶活等方面的改变[9]。乌日娜[10]在对乳酸菌的酸胁迫机理的研究发现,乳酸菌大部分的生长代谢都在低pH的酸性环境中进行,具有酸胁迫反应。在发酵制品中,菌体不可避免的会受到来自外界或内部的各种条件的胁迫制约,其中,乙醇胁迫为最常见的因素之一[11]。

乙醇是一种常见的有机溶剂,会对细胞及其内部组织功能与正常生理代谢活动产生影响[12],Graca da Silveira等[13]研究认为,在乙醇浓度为8%～10%(v/v)的条件下,细菌的生长会受到明显抑制,由于不同菌株的生理代谢活动均存在不同程度的差异,所以比较不同菌株的差异程度以选取优良菌种就十分必要,且菌体中不同酶的活性改变,如蛋白酶,是食品工业中使用最为广泛最重要的大分子活性物质[14],所以有较高的研究价值。本文主要以新疆巴音沟景区酸马奶为样品,选取不同种属的乳酸菌进行乙醇胁迫后再比较其存活率及蛋白酶性质,选取最佳耐受菌株,为我国发酵乳制品提供优质菌种资源及后续进一步研究菌体内部机理变化奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

酸马奶 本实验样品来源于新疆乌苏巴音沟景区。酸马奶的制备以鲜马奶为原材料,接种5%的“奶起子”后加以搅拌,在30 ℃条件下发酵7～10 h后在18 ℃条件下发酵6 h,再经冷却后即可储藏食用[4];无水乙醇 天津市富宇精细化工有限公司(乙醇质量分数≥99.7)。

MRS液体培养基[15-16]蛋白胨10.0 g/L,牛肉膏5.0 g/L,酵母粉5.0 g/L,葡萄糖20.0 g/L,吐温80 1.0 mL/L,磷酸氢二钾2.0 g/L,乙酸钠5.0 g/L,柠檬酸三铵2.0 g/L,硫酸镁0.58 g/L,硫酸锰0.25 g/L,调pH为6.2～6.4,于121 ℃灭菌20 min;MRS固体培养基 每1000 mL MRS液体培养基中加琼脂粉20 g,调pH6.2～6.4,于121 ℃灭菌20 min;改良MRS培养基 以MRS固体培养基为基础,加入2%的酪蛋白(干酪素),121 ℃灭菌20 min;生理盐水 氯化钠8.5 g定容至1 L,分装试管后121 ℃灭菌20 min。

SW-CJ-2D双人单面洁净工作台 江苏苏洁净化设备有限公司;DNP-9272型电热恒温培养箱 上海精宏实验设备有限公司;XH-C旋涡混合器 金坛市医疗仪器厂;LDZX-30KB6立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂;SL2002N电子天平 上海民桥精密科学仪器有限公司;GelDoc2000凝胶成像仪 美国伯乐BIO-RAD;Neofuge型高速冷冻离心机 力康发展有限公司;紫外分光光度计 郑州中谱仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株筛选 将酸马奶样品1 mL直接接种于MRS液体培养基中,37 ℃条件下活化24 h,用无菌生理盐水做10倍梯度稀释至10-7,而后取三个适当稀释梯度(10-5、10-6、10-7)的100 μL稀释菌液以同心圆形式涂布于MRS固体培养基上,待菌落形成稳定后,用接种环挑取分散的单个菌落,以之字形(或井字形)划线接种于MRS固体平板培养基中,37 ℃条件下培养48 h,此步骤重复两次以确保纯化菌体。将已经分离纯化的菌株进行革兰氏染色与接触酶实验后初步判定为乳酸菌再次活化后转接于含甘油及MRS液体培养基的冻藏管中,在-20 ℃下保藏备用。

1.2.2 菌株总DNA提取 采用细菌基因组总DNA提取试剂盒(离心柱型)提取所筛选菌株的总DNA。取1 mL菌液离心后弃上清,加入180 μL溶菌酶破壁处理后再加入20 μL蛋白酶K混匀。加入220 μL缓冲液与220 μL无水乙醇,充分振荡后倒入吸附柱,加入500 μL缓冲液后离心弃废液,加入600 μL漂洗液后离心弃废液,晾干,加入100 μL洗脱缓冲液静置后离心,收集溶液即得所需DNA。

1.2.3 PCR扩增 对所筛得全部菌株的16S rDNA进行聚合酶链式反应(PCR)扩增。PCR反应体系为50 μL,上下游引物各2 μL,DNA 稀释液2 μL,Mix预混液 25 μL,ddH2O 19 μL至终体积为50 μL;上游引物为341F(5-CCTACGGGNGGCWGCAG-3)、下游引物为805R(5-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3)。PCR反应条件:96 ℃预变性10 min,35个循环(95 ℃预变性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s),72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测,其结果通过凝胶成像仪进行观察。

1.2.4 菌株16S rDNA测序比对 在对经PCR扩增后的菌株进行进一步的分子生物学鉴定,对所扩增的16S rDNA序列进行测序分析,测序结果由上海生工生物工程股份有限公司官网下载后经NCBI官网中的Nucleotide BLAST中与已知序列进行比对,选择与其相似性最高的已知菌株,对两者相似性进行分析。使用MEGA5软件中的Neighbor-Joining Tree(邻接法)以自展值1000来进行系统发育树的建立,以判断菌株间的亲缘关系。

1.2.5 乙醇胁迫后乳酸菌存活率的测定 选取对数生长末期的菌株分别在培养基中加入不同浓度的乙醇进行胁迫,按2%的接种量选择以5%为起始浓度[17]开始胁迫,而后以1%浓度梯度逐级增加,胁迫12 h后对菌株进行10倍梯度稀释,选取适合梯度进行涂布培养,每个稀释度做2个平行实验,以国标(GB4789.2-94)为标准使用平板计数法选取最高耐受菌株并对不同浓度下乳酸菌的存活率进行测定。根据公式计算存活率[18]。

存活率(%)=不同乙醇体积分数胁迫后的活菌数(CFU/mL)/未添加乙醇的活菌数(CFU/mL)×100

式(1)

1.2.6 不同菌株的产蛋白酶比较及自溶度的测定 对所筛选出的不同类型菌株先以液体MRS进行活化后离心取上清液,在含酪蛋白的MRS培养基中以牛津杯选定区域后,取上清液15 μL接种量进行接种生长,于37 ℃培养24 h,测量菌落产生透明圈的大小[19]。在菌体生长繁殖的过程中,有许多条件都会引起菌体的自溶,如高温、营养条件改变、pH变化等[20],故对菌体的自溶度进行研究也很有必要。离心后的菌液进行重悬后使用分光光度计测600 nm处吸光度并计算菌体的自溶度。根据其公式计算自溶度[21]。

自溶度(%)=100-(A1/A2)×100

式(2)

式(2)中，A1:所测时间内最低吸光值;A2:所测时间内最高吸光值。

1.3 数据统计分析

使用Origin进行绘图，使用Excel进行绘图。p<0.05为差异显著，具有统计学意义。

图3 基于16S rDNA的耐受乙醇菌株系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA resistant strains of ethanol

2 结果与分析

2.1 筛菌结果

在酸马奶样品中共筛得21株疑似乳酸菌,并对其进行形态观察及革兰氏染色与接触酶实验,结果为革兰氏染色阳性(如图1所示),接触酶阴性,则初步判断所筛菌株为乳酸菌,其中球菌9株,杆菌12株。

图1 乳酸菌形态Fig.1 Morphology of lactic acid bacteria注:A:菌落外观;B:乳酸杆菌;C:乳酸球菌。

2.2 16S rDNA序列分析

2.2.1 16S rDNA分析 在对所筛选出的21株菌株的电泳检测图中可以发现,除marker条带外得到21条清晰的特异性条带,片段大小均在400～500 bp间,扩增产物片段大小与目的片段要求相符,电泳图像如图2所示。

图2 菌株16S rDNA电泳图Fig.2 16S rDNA electrophoresis of strains

2.2.2 系统发育树构建 在对所筛选出的菌株的测序结果经NCBI官网中的Nucleotide BLAST中的已知序列进行比对,对两者相似性进行分析。经比对后对菌株的种属进行分类,选取不同种属的12株菌株建立系统发育树,使用MEGA5软件中的Neighbor-Joining Tree(邻接法),设置自展值为1000,如图3所示。

通过比对系统发育树可知,17号、18号、19号、21号菌与Pediococcusacidilactici(乳酸片球菌)同源性为99%,即将其鉴定为乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici),20号与Pediococcuspentosaceus(戊糖片球菌)同源性为99%,即将其鉴定为戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus),7号与8号与Lactobacillusfermentum(发酵乳杆菌)同源性为100%,即将其菌株鉴定为发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum),9号、10号与Lactobacillusplantarum(植物乳杆菌)的同源性为100%,即将其菌株鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum),1号、2号与22号与Enterococcusfaecium(屎肠球菌)的同源性为98%,即将其菌株鉴定为屎肠球菌(Enterococcusfaecium)。

2.2.3 耐乙醇浓度比较 分析实验结果发现5%与8%分别为乳酸菌存活率的两个显著转折点,乙醇浓度在8%时对菌株的生长有明显的抑制作用,实验结果与朱敏等[12]的研究相符,乳酸菌的存活率均在乙醇浓度为8%有明显的抑制。

由表1可知,7号(发酵乳杆菌,Lactobacillusfermentum)与20号(戊糖片球菌,Pediococcuspentosaceus)菌株可耐受较高浓度乙醇胁迫,除1号(屎肠球菌,Enterococcusfaecium)外,其余4株菌株在5%浓度的乙醇胁迫下存活率均在20%以上,不同菌株间在乙醇胁迫下的存活率存在一定的差异性,且伴随乙醇浓度的提高,菌株的存活率在逐步降低。5株菌株在耐乙醇胁迫能力上由高到低分别为发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici),其中发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)与戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)为5种菌株中耐受度最高的菌株,能够耐受浓度为13%的乙醇胁迫,经实验发现,菌株对乙醇的耐受度与初始胁迫下的存活率关系不大,而与菌株种类有一定联系。

表1 不同菌种代表菌株乙醇胁迫后存活率Table 1 Survial rate of repre sentative strains under ethand stress

2.2.4 菌株蛋白酶水解情况 菌株能够水解固体培养基中的酪蛋白,从而产生透明圈,实验发现菌株的菌落多为乳白色且表面多光滑而有光泽,其在水解能力方面,以18号菌株(乳酸片球菌,Pediococcusacidilactici)的水解圈直径最大,为13.1 mm,1号菌株(屎肠球菌,Enterococcusfaecium)的水解圈最小,为7.6 mm,如表2所示。

表2 菌株蛋白酶水解情况Table 2 Protease hydrolysis of the strain

乳酸菌菌株的自溶能力会受到多种因素的影响。由图4可知,5株菌株在自溶能力方面各不相同,因菌株种属的不同,故存在一定的差异性。其中7号(发酵乳杆菌,Lactobacillusfermentum)其自溶能力最高,为39.1%,其次为18号(乳酸片球菌,Pediococcusacidilactici)36.4%,除1号菌菌株的自溶能力均在30%～40%之间。各菌株的自溶能力均达显著水平(p<0. 05)。菌株机体的自溶会使部分胞内酶释放,结合菌株蛋白酶水解情况可以发现,菌株自溶度与蛋白酶的水解能力相关。

图4 菌株自溶度比较Fig.4 Self-solubility comparison of strains

3 结论

于新疆酸马奶样品中筛选得到21株乳酸菌菌株,经测序比对后主要为乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)、发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)及屎肠球菌(Enterococcusfaecium)。对不同种属的菌株进行乙醇胁迫后发现发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)与戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)耐受乙醇浓度最高,均为13%,而后对5株菌株的蛋白酶水解能力进行测定,发现菌株均能产生蛋白酶用以水解干酪素,其中乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)水解产生的透明圈直径最大,为13.1 mm,对菌株自溶度测定后为36.4%。将菌株的乙醇耐受性与其蛋白酶水解能力相结合后发现,乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)蛋白酶水解能力较强，自溶度较高，但其耐受乙醇浓度不高,故菌株乙醇耐受能力与其蛋白酶活性及其自溶度无显著关联性。对菌株的深度探索研究,能够为我国发酵乳制品提供优质菌种资源并为后续进一步研究菌体内部各类酶活变化情况与基因差异奠定基础。

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Study on ethanol tolerance and protease properties oflactic acid bacteria from koumiss in Xinjiang areas

JIN Dan,JIANG Ai-ting,QIAO Chuan-li,LI Bao-kun*

(Livestock Laboratory,College of Food Institute,Shihezi University,Shihezi 832000,China)

The aim of the study was to investigate the ethanol tolerance and the differences of protease activity of different lactic acid bacteria strains,which were isolated and identified traditionally from Xinjiang loumiss.After different concentrations of ethanol stress for 12 h,the results showed the stress tolerance of 5 different strains from high to low wereLactobacillusfermentum,Pediococcuspentosaceus,Lactobacillusplantarum,Enterococcusfaecium,Pediococcusacidilacticiamong the 21 strains initially isolated,one of the which could withstand the highest concentration of 13% ethanol stress.We concluded that all strains could produce protease by measuring the proteolytic activity of the protease,it was worth mentioning that the diameter of the hydrolytic ring ofPediococcusacidilacticiwas the largest,which was 13.1 mm and the self-solubility was 36.4%.Results have also shown that the relationship between ethanol tolerance and protease hydrolysis was not significant.

kumiss;lactic acid bacteria;ethanol;protease;self-solubility

2016-12-06

金丹(1992-),女,硕士研究生,研究方向:畜产品加工与安全,E-mail:2624576602@qq.com。

*通讯作者:李宝坤(1979-),男,博士,副教授,研究方向：畜产品加工与质量安全,E-mail:45205350@qq.com。

国家自然科学基金地区项目(31560444)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)13-0136-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.13.025