秦 楠,缪文玉,李 鑫,郝 林,*

(1.山西中医学院制药与食品工程学院,山西太原 030619;2.太原城市职业技术学院管理工程系,山西太原 030027;3.山西农业大学食品科学与工程学院,山西太谷 030801)



解淀粉芽孢杆菌HRH317抗菌蛋白发酵条件优化及其稳定性研究

秦 楠1,缪文玉2,李 鑫3,郝 林3,*

(1.山西中医学院制药与食品工程学院,山西太原 030619;2.太原城市职业技术学院管理工程系,山西太原 030027;3.山西农业大学食品科学与工程学院,山西太谷 030801)

本文以抑菌圈直径为指标,采用单因素实验和响应面法对解淀粉芽孢杆菌HRH317菌株产抗菌蛋白的发酵条件进行优化。得到最佳发酵条件为:初始pH为7.0的NB培养液,接种量4%,37 ℃下振荡培养24 h,转速为200 r/min。在此条件下抗菌蛋白的抑菌圈直径达21.85 mm,结果表明该抗菌蛋白具有良好的抑菌效果。稳定性研究结果表明:蛋白在40～80 ℃、pH2～11稳定,对蛋白酶K有一定耐受性。

解淀粉芽孢杆菌,抗菌蛋白,响应面法,稳定性

霉菌是引起采后果蔬腐烂的重要因素之一。化学农药对环境和农产品的污染直接影响人类的健康,为了保证农产品的卫生和安全,利用微生物之间的寄生、拮抗作用已成为果蔬及粮食防霉的大势所趋[1-2]。

芽孢杆菌(Bacillus.spp)是拮抗细菌中的重点研究对象。其生长迅速,能够产生诸如抗菌蛋白、肽等抑菌有效成分,对人体无毒害、不造成环境污染[3-4]。Mohamed等[5]将1-MCP与解淀粉芽孢杆菌共同防治番木瓜病害,结果表明炭疽病和霉软腐病得到了有效的抑制,既控制了后熟,还保持了果实品质。郝卫宁等[6]研究了由解淀粉芽孢杆菌HC-03制备得到的菌株发酵液、菌悬液及发酵滤液,进行橘子青、绿霉病的防腐实验,有明显的抑菌作用。韩玉竹等[7]报道解淀粉芽孢杆菌H15产抗菌肽对粮食防霉方面效果显著。因此,芽孢杆菌及其代谢产物成为抑制真菌病害最有效的天然生物制剂[8-9]。在农产品防腐保鲜、病原物防治及植株促生等方面表现出良好的前景。本实验以解淀粉芽孢杆菌HRH317为出发菌株,对发酵时间、温度、pH、接种量、转速等条件进行单因素实验,并通过方差分析从中选出影响显著的因子进行响应面设计,从而获得抗菌蛋白的最佳发酵条件,同时对抗菌蛋白的稳定性进行了研究,为后期工业化生产和应用提供理论依据。

表1 单因素水平设计表Table 1 Levels design of single factor

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

解淀粉芽孢杆菌HRH317菌株(BacillusamyloliquefaciensHRH317)(编号:CGMCC No.7314)、禾谷镰孢菌(Fusariumgraminearum) 山西农业大学生物工程实验室;蛋白酶K(2000～5000 U/mg) solarbio公司;胰蛋白酶(2000～5000 U/mg)、胃蛋白酶(3000～3500 U/mg) 北京奥博星生物技术有限公司;硫酸铵、Tris、牛肉膏、蛋白胨 均为分析纯;营养琼脂(nutrient agar,NA)培养基 牛肉膏0.5 g、蛋白胨1 g、NaCl 0.5 g、琼脂1.5 g、水100 mL;马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar,PDA)培养基 马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、水1 L;营养肉汤(nutrient broth,NB)培养基 牛肉膏0.5 g、蛋白胨1 g、NaCl 0.5 g、水100 mL;马铃薯葡萄糖(potato dextrose broth,PDB)液体培养基 PDA培养基中不加琼脂。

DHP-500型电热恒温培养箱 北京光明医疗仪器厂;YXQ-LS-50SII立式压力蒸汽灭菌器 上海博迅实业有限公司医疗设备厂;BS210S电子天平 北京赛多利斯天平有限公司;HZQ-QX全温振荡摇床 哈尔滨东联电子技术开发有限公司;DL-6MS高速离心机 成都市生科仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 HRH317菌株抗菌蛋白的制备 将HRH317菌株种子液接种至装有30 mL发酵培养基的三角瓶中摇床培养获得发酵液。转移至EP管离心去沉淀,经孔径0.22 μm细菌过滤器过滤,即得无菌体培养滤液。缓慢加入硫酸铵至50%饱和度,收集沉淀蛋白。用原1/10体积0.02 mol/L pH6.8的Tris缓冲液溶解,装入透析袋后采用浓度相同的Tris缓冲液透析过夜,即得到抗菌蛋白[10],蛋白质浓度测定参照文献[11]。

1.2.2 指示菌菌悬液的制备 用接种环挑取一环禾谷镰孢病菌孢子接入装有5 mL灭菌生理盐水的试管中,稀释102倍后制成浓度为1.0×106个/mL的孢子悬液,备用。

1.2.3 HRH317菌株抗菌蛋白的抑菌活性测定 采用牛津杯法[12]。

1.2.4 HRH317菌株产抗菌蛋白发酵条件的优化

1.2.4.1 单因素影响实验 本实验选取不同发酵时间、温度、pH、接种量、转速进行单因素实验,各处理均在培养后,按照1.2.1取浓度(5.81±0.04) mg/mL的抗菌蛋白100 mL进行抑菌活性检测,记录抑菌圈直径作为指标。不同因子梯度条件见表1。

1.2.4.2 响应面法实验设计 基于单因素实验结果,采用中心组合实验Box-Behnken设计方案,以发酵时间(h)、接种量(%)以及转速(r/min)为考察因素,分别用X1、X2、X3来表示,并以+1、0、-1分别代表变量的水平,按方程xi=(Xi-X0)/ΔX对自变量进行编码,其中,xi表示变量的编码值,Xi表示变量的真实值,X0表示实验中心点变量的真实值,ΔX表示变量的步长变化,抗菌蛋白的抑菌圈直径Y表示响应值,见表2。

表2 中心组合实验Box-Behnken设计因素和水平编码值Table 2 Independent variables and levels in Box-Behnken CCD

1.2.5 稳定性实验

1.2.5.1 温度对抗菌蛋白的影响 取100 mL抗菌蛋白分别在40、60、80、100 ℃条件下水浴热处理30 min,121 ℃条件下热处理15 min,以未处理的样品作对照,以禾谷镰孢菌为指示菌分别做抑菌实验,测量抑菌圈直径,每处理设置3个重复。

1.2.5.2 pH对抗菌蛋白的影响 取100 mL抗菌蛋白分别置于11支离心管中,每管6 mL,用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH调其pH分别为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11,最终容积保持10 mL,以加等量蒸馏水稀释的菌液作为对照,然后37 ℃温浴4 h,后分别调至中性(pH6.5～7.5),以禾谷镰孢菌为指示菌分别做抑菌实验,测抑菌圈直径,每处理设置3个重复。

1.2.5.3 蛋白酶对抗菌蛋白的影响 取100 mL抗菌蛋白分装在1.5 mL 离心管中,分别加入5 mg/mL蛋白酶K、5 mg/mL胰蛋白酶、5 mg/mL胃蛋白酶,37 ℃水浴恒温2 h,以未添加蛋白酶处理的样品作为对照,以禾谷镰孢菌为指示菌用牛津杯法做抑菌实验,每处理设置3个重复。

1.3 数据分析

所有实验数据均采用Excel 2003、SAS 8.0和Design-Expert(version8.0.6)统计软件进行处理分析,应用最小差异显著法(LSD)进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 不同发酵时间对菌株抗菌蛋白抑菌活性的影响 由图1所示,发酵初期处于迟滞期,没有代谢大量的发酵产物。随着发酵时间的不断延长,抗菌蛋白粗提液抑菌圈直径呈现先增后降的趋势,发酵时间对其影响极显著(p<0.01),并在24 h时达到最大(20.35±0.61) mm。随时间继续增长,该菌株由稳定期进入降速期,菌数量逐渐减少,分泌抗菌蛋白能力降低导致抑菌活性逐渐减弱。

图1 发酵时间对菌株抗菌蛋白抑菌活性的影响Fig.1 Effect of fermentation time on inhibitory activity of antifungal protein of strain HRH317

2.1.2 不同发酵温度对菌株抗菌蛋白抑菌活性的影响 由图2所示,随温度升高,抑菌活性呈先上升后下降的趋势,发酵温度对其影响显著(p<0.05),当升至37 ℃时抑菌活性最高,抑菌圈直径(20.84±0.15) mm。说明细菌的生长繁殖及代谢产物的产生随温度升高而减少,由此可知,温度过高不适于菌株的生长。

图2 发酵温度对菌株抗菌蛋白抑菌活性的影响Fig.2 Effect of fermentation temperature on inhibitory activity of antifungal protein of strain HRH317

2.1.3 不同pH对菌株抗菌蛋白抑菌活性的影响 由图3所示,抑菌活性随pH提高呈现出先增加后下降的趋势,pH对其影响显著(p<0.05)。pH会影响细胞中代谢酶的活性,从而对其生长和代谢造成影响[13]。在pH2～4之间,抗菌蛋白抑菌活性相对较弱,表明菌株不能很好利用营养物质导致生长缓慢;在pH5～7之间,抑菌圈逐渐增大,并在pH7时抑菌活性最高,抑菌圈直径(19.96±0.89) mm;此后,抑菌活性随pH升高逐渐降低。结果表明该菌株对过酸和过碱的条件都比较敏感,抑菌活性受到影响。

图3 pH对菌株抗菌蛋白抑菌活性的影响Fig.3 Effect of pH values on inhibitory activity of antifungal protein of strain HRH317

2.1.4 不同接种量对菌株抗菌蛋白抑菌活性的影响 由图4 所示,抑菌活性随着接种量的增加呈现出不断增大然后缓慢降低的趋势,接种量对其影响极显著(p<0.01),并在4%时抑菌活性达到高峰,抑菌圈直径达(20.23±0.71) mm。随着接种量增大,抑菌活性开始出现降低的趋势,这是由于在一定量培养基内,菌数增加产生空间与营养竞争,从而抑制菌体正常的生长,进而致使抑菌物质减少。因此,4%的接种量有利于抗菌粗蛋白的分泌和积累。

图4 接种量对菌株抗菌蛋白抑菌活性的影响Fig.4 Effect of inoculation volume on inhibitory activity of antifungal protein of strain HRH317

2.1.5 不同摇床转速对菌株抗菌蛋白粗提液抑菌活性的影响 由图5所示,抑菌活性随着转速的加快呈现出先升后降的趋势,摇床转速对其影响极显著(p<0.01),在转速为150 r/min时,抑菌活性最高,抑菌圈直径为(21.89±0.88) mm。摇床转速是影响抗菌蛋白抑菌活性的主要因子,摇床发酵培养可增加通气量。转速太慢,通气量小,不利于菌体生长;转速过快,可能会导致菌体自溶,使生物量减少[14]。

图5 摇床转速对菌株抗菌蛋白抑菌活性的影响Fig.5 Effect of shaker rotation speed on inhibitory activity of antifungal protein of strain HRH317

2.2 响应面分析

2.2.1 响应面实验设计与结果 如表3所示,17个实验点中12个是析因点,5个是零点,析因点是自变量取值在X1、X2、X3所构成的三维顶点,零点表示区域的中心点,其中重复零点实验5次,用以估算实验误差。

表4 二次回归模型的方差分析结果Table 4 Analysis of variance for each item of developed quadratic regression model

注:* 代表差异显著(p<0.05),**代表差异极显著(p<0.01)

表3 Box-Behnken设计方案及抑菌直径Table 3 Box-Behnken CCD matrix and response values of inhibition zone diameter(IZD)

2.2.2 模型的建立及其显著性检验 利用Design-Expert(version8.0.6,Stat-EaseInc.,MinneapolisN. USA)软件对表3实验数据通过多元回归拟合,获得抑菌圈直径(Y)对发酵时间(X1)、接种量(X2)和转速(X3)的二次多项回归模型为:

Y=20.95-1.02X1+0.67X2-0.020X3+1.13X1X2-0.45X1X3+0.19X2X3-0.761X12-1.24X22-0.70 X32

从方差分析表4中得出模型F值为5.59,对应的p<0.05,达到显著水平,失拟项的p=0.6533>0.05不显著,说明该模型拟合程度较好,实验误差小,可以用此模型预测解淀粉芽孢杆菌HRH317抗菌蛋白发酵条件对抑菌活性的影响。回归方程系数显著性检验结果:X1时间的一次项极显著(p<0.01),X2接种量的一次项及二次项显著(p<0.05),交互项X1X2显著(p<0.05),其他项均不显著。由F值得出实验各因素对抑菌活性影响的主次顺利为:X1>X2>X3,即时间>接种量>转速。

根据模型方程绘制响应面图,分别见图6～图8。其中每个响应面分别代表两个变量在恒定值(取零水平值)下,另外两个独立变量之间的相互作用。

图6显示在转速水平为0,即150 r/min时,发酵时间与接种量对抑菌圈直径的交互影响效应,二者具有显著交互作用(p<0.05)。抑菌圈直径随着发酵时间逐渐延长呈下降趋势,这是由于菌龄过大,细菌菌体可能会出现形态变异、自溶等现象,生理代谢活动渐趋停滞,可代谢抑菌物质的活菌数量降低,故而致使抑菌物质抗菌蛋白产量减少。当接种量范围在3%～4%时抑菌圈直径呈现递增趋势,随着接种量的继续加大,抑菌圈直径逐渐下降。

图6 发酵时间与接种量对抑菌圈直径的响应面及等高线图Fig.6 Three-dimensional response surface graphs and the contour plots of fermentation time and inoculation volume on IZD

图7显示在接种量水平为0,即4%时,转速与发酵时间对抑菌圈直径的交互作用不显著。发酵时间曲线表现较为平缓,在24～48 h的范围内变化不太明显。转速曲线有增长趋势,表明随着转速的加快,摇瓶内发酵液的溶氧量不断增加,菌株的生长繁殖加快,发酵液的抑菌活性也随之增加。

图7 发酵时间与转速对抑菌圈直径的响应面及等高线图Fig.7 Three-dimensional response surface graphs and the contour plots of fermentation time and shaker rotation speed on IZD

图8显示在发酵时间水平为0,即24 h时,转速与接种量对抑菌圈直径的交互作用不显著。转速曲线表现较为平缓,抑菌圈直径在100～200 r/min的范围内变化不太明显。接种量范围在3%～4%时抑菌圈直径呈增加趋势,随着接种量的继续加大,抑菌圈直径逐渐下降。

图8 转速与接种量对抑菌圈直径的响应面及等高线图Fig.8 Three-dimensional response surface graphs and the contour plots of shaker rotation speed and inoculation volume on IZD

2.2.4 验证性实验 通过Design-Expert(version8.0.6)软件分析,获得解淀粉芽孢杆菌HRH317产抗菌蛋白发酵工艺的最适条件为:发酵时间24.4 h,接种量4.05%,转速219 r/min,所得抗菌蛋白对禾谷镰孢菌抑菌作用强。考虑实际操作的方便性,将最适发酵参数修正为:发酵时间24 h,接种量4%,转速200 r/min,在最适条件下进行了3组重复性实验,平均抑菌圈直径为21.85 mm,与预测值22.05 mm拟合度良好,无显著性差异(p>0.05),表明实验确定的模型条件可以用于预测实际值,此方程有效可靠。

2.3 稳定性实验结果

2.3.1 温度对抗菌蛋白抑菌活性的影响 如图9所示,该抗菌蛋白热稳定性良好。在40～60 ℃下处理30 min后,其抑菌效果变化不大,表明稳定性较好;温度升至80 ℃下处理30 min,与对照相比其抑菌活性下降了30.9%,稳定性受到影响;在100 ℃处理30 min抑菌活性显著下降。结果表明,该抗菌蛋白在40～80 ℃具有良好的热稳定性。

图9 温度对抗菌蛋白抑菌活性的影响Fig.9 Effect of temperature on inhibitive activity of antifungal protein注:柱子上方不同小写字母表示差异显著(p<0.05)。图10同。

2.3.2 pH对抗菌蛋白抑菌活性的影响 如图10所示,抗菌蛋白对酸、碱具有很好的稳定性。与对照相比,在pH7～8 范围内抑菌活性基本不变,在pH2和pH11时仍分别保留原有活性的63.6%、71.4%。结果表明该抗菌蛋白pH范围较宽,同时说明其具有良好的酸碱稳定性。因此实际应用中该抗菌蛋白可适应酸性、中性、碱性的条件。

图10 pH对抗菌蛋白抑菌活性的影响Fig.10 Effect of pH value on inhibitive activity of antifungal protein

表5 蛋白酶对抗菌蛋白抑菌活性的影响Table 5 Effect of the protease on inhibitive activity of antifungal protein

注:抑菌圈直径数据后的小写字母不同表示差异显著(p<0.05)。2.3.3 蛋白酶对抗菌蛋白抑菌活性的影响 由表5可见,蛋白酶K与对照相比差异不显著(p>0.05),表明抗菌蛋白对其有一定耐受性;经胰蛋白酶及胃蛋白酶处理,与对照相比,活性显著下降,表明抗菌蛋白对二者敏感,即抗菌蛋白可被人体消化系统中的蛋白酶消化掉,不会对肠道内有益微生物菌群造成影响,同时也不会对人体产生不利的影响。因此该抗菌蛋白在食品果蔬防腐及生防中将会有很好的应用。

3 讨论与结论

菌株产抗菌物质能力的高低对微生物相关产品的生产和开发起着决定性的作用,然而微生物的发酵条件优化恰恰又是一个关键步骤。响应面法所需实验次数少,而且可以预测因素之间的相互作用,此方法进行参数优化的应用越来越广泛[15-16]。郝秋娟等[17]采用分段控温工艺优化解淀粉芽孢杆菌BS5582产蛋白,得到最佳条件:接种量6.67%、转速500 r/min,发酵温度35 ℃、经过27 h发酵后温度降至32 ℃继续发酵,蛋白酶活在47.75 h达到9838 U/mL。方传记[18]对ES-2-4产脂肽类抗菌物质产量的发酵条件采用Plackett-Burman Design 方法进行优化,得到最佳条件,葡萄糖42 g/L、L-谷氨酸钠14 g/L、温度27 ℃、转速200 r/min、接种量4%、装液量50 mL、摇床培养36 h,此条件下脂肽类抗菌物质的产量为6.76 g/L。本实验采用单因素与响应面法对解淀粉芽孢杆菌HRH317产抗菌蛋白的发酵条件进行了初步研究,研究结果表明,发酵时间、摇床转速及接种量是影响抗菌蛋白产量的主要因素,其中,接种量与发酵时间有显著的交互作用。最佳条件为:在初始pH为7.0的NB培养液,接种量4%,37 ℃下振荡培养24 h,转速为200 r/min,在此条件下抗菌蛋白的抑菌圈直径达21.85 mm。

目前,国内关于芽孢杆菌抗菌蛋白的研究仍处于探索抗菌混合物基本特性的阶段,很多研究成果是有关脂肽类抗菌素,抗菌蛋白的报道相对较少[19-21]。芽孢杆菌抗菌蛋白一般具有抗真菌和细菌等特性,其抗菌谱广、稳定性高、对热、酶不敏感[22]。本研究中,实验菌株所产抗菌蛋白在40～80 ℃热稳定性良好,在100 ℃与121 ℃下分别处理30 min与15 min,抑菌活性显著下降。这与学者刘永峰[23]研究枯草芽孢杆菌Bs-916胞外抗菌蛋白在120 ℃时仍具有一定的抑菌活性一致。所产抗菌蛋白有较宽的pH范围,说明耐酸碱性好。对蛋白酶K不敏感,这与学者张宝俊[24]和王军华[25]研究的解淀粉芽孢杆菌LP-5抗菌蛋白和解淀粉芽孢杆菌Q-12抗菌蛋白均对蛋白酶K不敏感相同,但对胰蛋白酶、胃蛋白酶较敏感这一方面有区别。这说明该抗菌蛋白能被人体蛋白酶所降解,这对其在果蔬和食品防腐领域应用具有重要意义。

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Optimization and stabilization of antifungal proteinfromBacillusamyloliquefaciensstrain HRH317

QIN Nan1,MIAO Wen-yu2,LI Xin3,HAO Lin3,*

(1.College of Pharmaceutical and Food Engineering,Shanxi University of Traditional Chinese Medicine,Taiyuan 030619,China;2.Department of Management Engineering,Taiyuan City Vocational College,Taiyuan 030027,China;3.College of Food Science and Engineering,Shanxi Agricultural University,Taigu 030801,China)

This paper is concerned with the antifungal protein extraction from the strainsBacillusamyloliquefaciensHRH317. The inhibitive circle diameter as evaluating indicator,the fermentation condition were optimized by single factor experiments and response surface methodology(RSM). The results showed the optimized extraction parameters were that the initial pH value of nutrient broth medium(NB)was 7,inoculation volume of 4%,37 ℃,and the shaker rotation speed 200 r/min. The inhibitive circle diameter was up to 21.85 mm. The results indicated that the antifungal protein was proved to have strong inhibition effect. The antifungal protein was tested to have strong tolerant to proteinase K,which could be steady with 40～80 ℃ and pH2～11.

Bacillusamyloliquefaciens;antifungal protein;response surface methodology;stability

2016-12-23

秦楠(1981-),男,博士,讲师,研究方向:食品微生物及功能食品加工,E-mail:bszy6688@163.com。

*通讯作者:郝林(1957-),男,博士,教授,研究方向:食品微生物与发酵技术,E-mail:sxhaolin2014@163.com。

山西省卫计委科研项目(201601115);山西中医学院博士科研启动基金资助；国家科技支撑计划(2012BAD38B07)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)13-0130-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.13.024