苗艳丽,陈绍红,余广仁,杨丽红,冯焕焕,邝嘉文,张兆霞,*

(1.广东海洋大学化学与环境学院,广东湛江 524088;2.广东海洋大学食品科技学院现代生物化学实验中心,广东湛江 524088)



酶解水牛奶制备抗凝血肽的工艺研究

苗艳丽1,陈绍红2,*,余广仁1,杨丽红1,冯焕焕1,邝嘉文1,张兆霞1,*

(1.广东海洋大学化学与环境学院,广东湛江 524088;2.广东海洋大学食品科技学院现代生物化学实验中心,广东湛江 524088)

目的:本文以新鲜水牛奶为原料,研究木瓜蛋白酶、中性蛋白酶及碱性蛋白酶复合酶解、混合酶解水牛奶的作用,比较不同水解方式的作用效果;并采用凝血酶滴定改进法测定水解液抗凝血活性。方法:分别进行三种蛋白酶单因素水解实验,确定各种酶的最适水解条件;在此基础上进行复合酶解与混合酶解实验,测定水解度和抗凝血活性。结果:木瓜蛋白酶的最适水解条件为:水解温度60 ℃、水解时间 2.0 h、pH5.0、料水比1∶2(v/v)、酶用量 6000 U/(mL底物);中性蛋白酶的最适条件为:水解温度40 ℃、水解时间 3.0 h、料水比1∶2(v/v)、pH6.0、酶用量 6000 U/(mL底物);碱性蛋白酶的最适条件为:水解温度50 ℃、水解时间 4.0 h、料水比1∶2(v/v)、pH8.0、酶用量6000 U/(mL 底物)。复合酶解法制备的水解液其抗凝血活性均高于混合酶解,最高抗凝血活性为52.0 ATU/mL。结论:本实验条件下,加酶组合为“中性蛋白酶-木瓜蛋白酶-碱性蛋白酶”的复合酶解制备的水解液具有最高的抗凝血活性,即52.0 ATU/mL。

水牛奶,混合酶解,复合酶解,抗凝血活性,抗凝血肽

心脑血管疾病已成为我国发病率、致死率最高的疾病,其中大部分疾病与血栓相关[1-2]。而临床上使用的肝素、香豆素、链激酶、尿激酶等物质易引发出血等副作用。近些年来从水蛭、蜱虫、钩口线虫、蛇毒和蜂毒中提取的抗凝溶栓活性物质具有良好的抗凝血效果,但毒副作用大[3-5]。来源于酪蛋白、大豆蛋白、花生、蛋清等食品原料的抗凝血活性肽,因其可以被人体消化和吸收,能有效地进入凝血系统,进而发挥作用,具有较高的安全性等特点[6],已经成为当前多肽类药物和保健食品的研究热点。

研究发现,酪蛋白分子中含有若干具有抗凝血酶活性的肽段——抗凝血肽[7-8],在合适的工艺条件下水解酪蛋白,可获得功能与水蛭素类似的抗凝血肽。前期我们已经利用木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶进行酪蛋白多酶混合水解,发现水解后的产物具有较强的抗凝血活力[9]。牛奶中酪蛋白占总蛋白总量的80%,而且水牛奶中的酪蛋白含量高于普通牛奶,采用合适的蛋白酶酶解之后制备具有抗凝血活性的小肽类物质,制备工艺条件简单,可以节约分离纯化酪蛋白的大量成本和劳动力。目前,国内外以富含蛋白质的常规食材为原料制备抗凝血活性肽的研究还处于起步阶段[8-12],其中刘恭等以牦牛乳酪蛋白为原料,采用胰蛋白酶酶解酪蛋白制备抗凝血肽[8];本人以酪蛋白为原料,采用混合酶解法制备了有较高活性的抗凝血肽[9];胡永倩等以花生分离蛋白为研究对象,通过酶法制备花生肽,并分析了高抗凝花生肽的一级结构[10]。

本实验旨在已有的工作基础上,以富含蛋白质的常规食材——水牛奶为原料,通过生物化学加工方法处理后,制备具有抗凝血活性的小肽类物质,为后期开发以其作原料的防治血栓性疾病的口服小肽类药物或功能性食品提供理论及实验依据。本实验用酶解法水解食物蛋白,制备具有抗凝血活性的小肽类物质,产品本身具有绿色属性,而且所需原材料来源丰富、成本低、制备工艺条件简单。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

凝血酶对照品 湖南一格制药有限公司,批号140701-2,2000 NIH/瓶;酪蛋白(化学纯) 国药集团试剂有限公司;木瓜蛋白酶(Pa)6×105U/g、中性蛋白酶(NP)2×105U/g、碱性蛋白酶(AP)4×105U/g 广西庞博公司,食品级;牛血纤维蛋白原 美国Biosharp公司,进口分装;其他试剂均为国产分析纯。

THZ-82恒温振荡器 国华器械;CR22G高速冷冻离心机 HITACHI公司;HH-6型三用电热恒温水箱 金坛市富华仪器有限公司;EL200电子天平 日本岛津公司;JH-752型紫外可见分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司;PHS-2F pH计 上海雷磁新泾仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 蛋白酶活力测定 蛋白酶活力定义为1 g固体酶粉(或1 mL液体酶)在最适条件下,每分钟水解酪蛋白释放出1 μg酪氨酸所需要的酶量为1个蛋白酶活力单位U。生成的酪氨酸量用紫外光谱法测定。3种蛋白酶使用前测定其实际活力,活力测定参照任清[13]的方法并有改动,具体测试过程如下。

1.2.1.1 酪氨酸标准曲线的绘制 用100 μg/mL酪氨酸标准溶液配制标准系列溶液,于275.0 nm处测定吸光度,绘制标准曲线。

1.2.1.2 蛋白酶活力的测定 待测酶液的制备：称取酶粉(0.5±0.0002) g,精确至0.000 1 g,用少量该酶的最适pH最接近的缓冲溶液溶解,移入100 mL容量瓶中,用最适pH缓冲溶液定容至刻度,摇匀。冷藏，用于酶水解和酶活力测定。

测定步骤:先将酪蛋白溶液放入40 ℃恒温水浴预热5 min。然后按下列步骤操作:试管A(空白)→加蒸馏水1.00 mL→加三氯乙酸2.00 mL→40 ℃,加热5 min→加酪蛋白溶液1.00 mL→40 ℃,加热10 min→静置10 min,过滤→定容10.00 mL，于275 nm波长测A。试管B(四种不同的待测酶液,分别平行三份)→分别吸取1.00 mL→加酪蛋白溶液1.00 mL→40 ℃,加热10 min→加三氯乙酸2.00 mL→40 ℃,加热5 min→静置10 min,过滤→定容10.00 mL于275 nm波长测B。蛋白酶活力由下式计算得到:

酶活力(U/g或U/mL)=(n×c×F)/(10m)

式(1)

式(1)中,C-根据标准曲线查得的水解液中酪氨酸质量浓度(μg/mL);n-水解液体积(mL);F-稀释倍数;10-水解时间(min);m-酶质量(g)或体积(mL)。

1.2.2 化学成分测定 总氮量(TN):凯氏定氮法[14];氨基氮量(AN):中性甲醛滴定法[10]。

水解度(DH,%)=水解液氨基氮量(mg)×100/总氮量(mg)

式(2)

1.2.3 酶解液抗凝血活性测定

1.2.3.1 抗凝血活性试剂的配制 Tris-HCl缓冲溶液:精确称取 0.7980 g Tris-HCl 溶于少量蒸馏水并定容于100 mL容量瓶,用稀NaOH溶液调pH至7.4。

0.5%牛血纤维蛋白原:精确称取30 mg溶于6 mL Tris-HCl缓冲溶液。

凝血酶溶液配制[15]:凝血酶浓度用单位体积溶液中凝血酶活力单位(NIH)数量多少(NIH/mL)表示。取一定量凝血酶标准品用适量生理盐水溶解,配制凝血酶浓度分别为 20(作为基准浓度,即1倍),40(即2倍)、100(即5倍)、200、400 NIH·mL-1的系列标准溶液。

1.2.3.2 抗凝血活性测定 用凝血酶滴定改进法测定水解物的抗凝血酶活力[16]。取几支7.5 mm×100 mm的小试管,各加入0.5%纤维蛋白原200 μL,再精密移取酶解液50 μL,放在37 ℃恒温水浴锅中5 min。取其中一支试管,滴加5倍的凝血酶溶液5 μL,迅速摇匀,若1 min内凝固,说明酶液中含有的抗凝血活性少于0.5 ATU;重新取另一支试管,加入1倍的酶液5 μL,迅速摇匀,若1 min内不凝,再加入1倍的酶液5 μL,直到1 min内凝固为止。

活性用抗凝血酶活性单位(ATU)表示,含量按下式计算:

U=20C

式(3)

式(3)中,C为每50 μL待测(供试品)溶液含ATU的单位数,U为每1 mL待测溶液含ATU数。

1.2.4 三种蛋白酶的单因素水解实验

1.2.4.1 原料处理 取一定量的水牛奶50 mL置于试管中,高速离心机以6000 r/min离心15 min,取出,去除上层的脂肪层,得脱脂水牛奶。牛奶脱脂后调pH至10左右煮沸10 min,放冷至室温,用稀盐酸或氢氧化钠调到酶解所需pH。

按下述条件进行酶解,水解结束后升高水解液温度至95 ℃,保持 10 min。放冷至室温后,以6800 r/min离心20 min,取上清液,用甲醛滴定法测定水解度。对照组所用蛋白酶先行灭活,其余实验条件和实验组相同。反应完毕,放冷至室温,6800 r/min离心15 min,取滤液作为相应样品管测定水解度的对照。

1.2.4.2 温度对水解度的影响 取10.0 mL脱脂牛奶,加入6000 U/(mL底物)木瓜蛋白酶(或中性蛋白酶或碱性蛋白酶)溶液,料水比为1∶2(v/v),将pH调为7.0,温度分别设为40、50、60、70、80 ℃，水解3.0 h;测定水解度,确定最适水解温度。

1.2.4.3 时间对水解度的影响 取10.0 mL牛奶,加入6000 U/(mL底物)木瓜蛋白酶(或中性蛋白酶或碱性蛋白酶),料水比为1∶2(v/v),将pH调为7.0,60 ℃恒温水解1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 h,测定水解度,确定最适水解时间。

1.2.4.4 pH对水解度的影响 取10.0 mL处理过的水牛奶,加入6000 U/(mL牛奶)木瓜蛋白酶(或中性蛋白酶)溶液,调pH分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0(碱性蛋白酶酶解时调pH分别为6.0、7.0、8.0、9.0、10.0),料水比为1∶2(m/v),60 ℃水解3 h;测定水解度,确定最适水解pH。

1.2.4.5 料对比对水解度的影响 取10.0 mL处理过的水牛奶,加入6000 U/(mL牛奶)木瓜蛋白酶(或中性蛋白酶或碱性蛋白酶),料水比分别为1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5(v/v),将pH调为5.0,60 ℃恒温水解3.0 h,测定水解度,确定最适水解料水比。

1.2.4.6 酶用量对料水比的影响 取10.0 mL处理过的水牛奶,加入20 mL蒸馏水,加入木瓜蛋白酶(或中性蛋白酶或碱性蛋白酶),将pH调为5.0,酶用量分别为1 mL 牛奶加入2000、4000、6000、8000、10000 U木瓜蛋白酶,60 ℃恒温水解3.0 h,测定水解度,确定最适酶用量。

1.2.5 水牛奶的混合酶解实验 混合酶水解是指若干种酶按一定的比例混合均匀后,在某种酶的最适水解条件下水解底物。例如由A、B两种酶组成的混合酶解系统,具体做法是:先了解这两种酶的最适温度、最适pH、最适底物浓度、最适料水比、最适反应时间,然后进行酶解。取一定量底物(A、B两种酶最适底物浓度之和)在A酶的最适水解条件水解,水解完成后,升高水解液温度至100 ℃保持10 min灭A酶的活力,测定其水解度;取一定量底物(A、B两种酶最适底物浓度之和)在B酶的最适水解条件水解,水解完成后,升高水解液温度至100 ℃保持10 min灭B酶的活力,测定其水解度。比较这两个水解度的高低。如果一个混合酶解系统由3种或4种酶组成,实验方法与此相同,但过程要复杂一些[17]。

中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶共组成9种不同混合酶组合(具体见表6)。9个250 mL具编号的锥形瓶,各加入处理过的水牛奶10.0 mL、蒸馏水20 mL,按照最适酶用量加入已预热的2种或3种酶液,分别在木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶的最适温度、最适时间进行水解。酶解结束后升高水解液温度至100 ℃,保持 10 min灭酶。把酶解液置于离心机中以6800 r/min离心15 min,取上清液测定其水解度和抗凝血活性。

1.2.6 水牛奶的复合酶解实验 复合酶水解是先按在某种酶的最适水解条件下水解底物,然后灭活,再按另一种酶在其最适条件下水解。

例如由A、B两种酶组成的复合酶解系统,具体做法是:先了解这两种酶的最适反应时间、最适料水比、最适pH、最适温度、最适酶用量,然后进行两种方式酶解:取一定量底物在A酶的最适水解条件水解,水解完成后,升高水解液温度至100 ℃保持10 min灭A酶的活力,再在B酶的最适水解条件下水解,水解完成后,升高水解液温度至100 ℃保持10 min灭B酶的活力,然后测定其水解度;取一定量底物在B酶的最适水解条件水解,水解完成后,升高水解液温度至100 ℃保持10 min灭B酶的活力,再在A酶的最适水解条件下水解,水解完成后,升高水解液温度至100 ℃保持10 min灭A酶的活力,然后测定其水解度。比较这两个水解度的高低[17]。

Zhao等[18]研究酶解海参蛋白发现使用菠萝蛋白酶、脘酶及碱性蛋白酶3种蛋白酶共同作用,水解效果要优于单一蛋白酶。由于单凭一种酶有时很难达到预期效果,可选用多酶组合或复合酶系水解目标蛋白质[19],复合酶系的降解效果一般较好[20]。本论文采用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶3种蛋白酶水解水牛奶制备抗凝血小肽。中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶共组成12种不同的复合酶组合(具体见表7)。12个250 mL具编号的锥形瓶,各加处理过的水牛奶10.0 mL、蒸馏水20 mL和二酶、三酶复合组合中的第一种酶,在该酶的最佳工艺条件下进行水解。水解完成后,灭酶,依次加入第二种、第三种酶,操作同前者。反应完成后,以6800 r/min离心15 min,取上清液测水解度和抗凝血活性。

2 结果与分析

2.1 酪氨酸标准曲线的绘制

酪氨酸标准曲线如图1,且方程决定系数(R2=0.997)较高,说明该曲线拟合程度比较好。

表3 水解pH对水解度的影响Table 3 Effect of pH on hydrolysis degree

图1 酪氨酸标准曲线Fig.1 The standard curve of tyrosine

2.2 三种蛋白酶单因素水解实验

2.2.1 温度对酶解效果的影响 水解温度对木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶水解度影响如表1。

表1 水解温度对水解度的影响Table 1 Effect of temperature on hydrolysis degree

由表1可以看出随着温度的不断升高,木瓜蛋白酶对水牛奶的水解度也不断增加,当温度在60 ℃的时候,水解度达到最高点;可当温度高于60 ℃,由于温度过高从而降低了酶的活性,相应水解度也降低,因此木瓜蛋白酶的最适温度为60 ℃。同理得出中性蛋白酶和碱性蛋白酶的最适温度均是50 ℃。

2.2.2 时间对水解度的影响 水解时间对木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶水解度影响如表2。

表2 水解时间对水解度的影响Table 2 Effect of hydrolysis time on hydrolysis degree

如表2可见,在1.0～3.0 h之间,酶的水解度变化最大,之后水解度变化小。由于酶具有专一特性,随时间延长,溶液中能被水解的特定蛋白质的量减少,导致水解时间虽长,但水解度增加不明显;另外，考虑到生产效率,所以木瓜蛋白酶的最适反应时间确定为2.0 h。同理确定中性蛋白酶和碱性蛋白酶的最适反应时间分别是3.0、4.0 h。

2.2.3 pH对酶解效果的影响 水解pH对木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶水解度影响如表3。由表3明显的可以看到,当pH从4.0逐渐增加到5.0的时候,水解度不断增加;且在pH5.0时水解度达到最大值,当pH超过5.0时,水解度明显下降;表明过高或过低的pH都会抑制木瓜蛋白酶的活性,使其水解度下降;因此木瓜蛋白酶最适pH为5.0。同理确定中性蛋白酶和碱性蛋白酶的最适pH分别是6.0和8.0。

2.2.4 料水比对酶解效果的影响 水解料水比对木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶水解度影响如表4。

表4 水解料水比对水解度的影响Table 4 Effect of ratio of material to water on hydrolysis degree

表4可见随着料水比逐渐增加,水解度也是逐渐增大的。原因是加水充足,酶与底物充分接触,有利于酶促反应。但如果加水量过大,酶浓度降低,与底物接触的单位酶量减少,不利于酶促反应,而且在1∶2(v/v)时水解度达到最高,因此最佳料水比选1∶2(v/v)。同理确定中性蛋白酶和碱性蛋白酶的最适料水比均为1∶2(v/v)。

2.2.5 酶用量对酶解效果的影响 水解酶用量对木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶水解度影响如表5。由表5可以看到随着酶用量的增大,水解度是在不断增加的,在2000～6000 U/mL底物间增幅是最大的,用量超过6000 U/mL底物的时候其水解度增加不明显,从生产工艺上讲,虽说水解度越大越好,可是增加的幅度不大,耗时耗能不经济,因此最适的酶用量为6000 U/(mL底物)；同理确定中性蛋白酶和碱性蛋白酶的最适酶用量均为6000 U/(mL底物)。

表5 水解酶用量对水解度的影响Table 5 Effect of enzyme concentration on hydrolysis degree

从表1～表5可知,木瓜蛋白酶的最适水解条件为:水解温度60 ℃、水解时间 2.0 h、pH5.0、料水比1∶2(v/v)、酶用量 6000 U/(mL 底物);中性蛋白酶的最适条件为:水解温度40 ℃、水解时间 3.0 h、料水比1∶2(v/v)、pH6.0、酶用量6000 U/(mL底物)。碱性蛋白酶的最适条件为:水解温度50 ℃、水解时间4.0 h、料水比1∶2(v/v)、pH8.0、酶用量6000 U/(mL底物)。

2.2.7 水牛奶的混合酶解实验 由表6的数据可见,混合酶解的组合中,组合“中性-碱性-木瓜”混合酶解液的水解液水解度较高,而且抗凝血活性最好。三种蛋白酶混合最佳加酶顺序为“中性蛋白酶-碱性蛋白酶-木瓜蛋白酶”,其抗凝血活性为21.0 ATU/mL。

表6 混合酶解液的水解度和抗凝血活性的测试Table 6 Mixed enzyme degree of hydrolysis and anticoagulant activity test

注:表中的各组合以第一个酶的最适条件进行混合酶解。

2.2.8 水牛奶的复合酶解实验 12种复合酶组合的水解度和抗凝血活性测试结果见表7。数据显示,按照表7中的组合11的加酶顺序“中性-木瓜-碱性”进行复合酶解,其制备的水解液的水解度和抗凝血活性均最高,3次验证实验的水解度分别为:38.12%、38.30%、38.20%,平均38.20%;活性测试结果分别为:51.0、52.5、51.5 ATU/mL,平均为51.5 ATU/mL,表明该工艺稳定可靠。

表7 水牛奶复合酶解液的水解度和抗凝血活性测试Table 7 Composite enzyme degree of hydrolysis and anticoagulant activity test

而且对比表6和表7的结果,可见复合酶解液的抗凝血活性均比混合酶解液的活性高,因此,酶解水牛奶制备抗凝血肽的最优工艺即为:“中性蛋白酶-木瓜蛋白酶-碱性蛋白酶”的三酶复合酶解。最佳工艺条件为:在250 mL锥形瓶中加入处理过的水牛奶10.0 mL,然后加入中性蛋白酶,在 pH6.0、料水比1∶2、温度40 ℃、酶用量6000 U·(mL-1底物)的条件下水解3.0 h;水解完成后,灭酶;然后按6000 U·(mL-1底物)加入木瓜蛋白酶,在 pH5.0、温度60 ℃ 水解2.0 h;水解完成后,灭酶;最后按6000 U·(mL-1底物)加入碱性蛋白酶,在pH8.0、温度50 ℃、水解4.0 h。反应完成后,以6800 r/min离心15 min,取上清液。

3 结论

本实验通过中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶的单因素实验,2酶和3酶的混合酶解和复合酶解,采用凝血酶滴定改进法,对抗凝血活性进行了检测,得到水牛奶抗凝血肽的最佳制备工艺条件为:“中性蛋白酶-木瓜蛋白酶-碱性蛋白酶”的组合进行的三酶复合酶解,在该条件下制备的酶解液的抗凝血活力为52.0 ATU/mL。

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Study on technology conditions of preparation for anticoagulant peptidefrom buffalo milk by enzymatic hydrolysis

MIAO Yan-li1,CHEN Shao-hong2,*,YU Guang-ren1,YANG Li-hong1,FENG Huan-huan1,KUANG Jia-wen1,ZHANG Zhao-xia1,*

(1.College of Chemistry and Environment of Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524088,China;2.College of Food Science and Technology,Modern Biochemistry Experimental Center,Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524088,China)

Objective:Research on buffalo milk affected by the systems about mixed enzyme and composite enzyme including papain,neutral protease and alkaline protease,comparing with the result in different ways of hydrolysis. Method:First,the experiment went on with the single factor of three proteases hydrolyzing milk to explore the optimum condition of enzymatic hydrolysis. On this basis,the degree of hydrolysis was determinated through composite enzymatic hydrolysis and mixed enzyme and anticoagulant activity was determinated. Consequence:The results showed that optimum condition of papain were as follows:the ratio of material to water for 1∶2,pH=5.0,temperature 60 ℃,time 2 h,enzyme dosage 6000 u/mL. Neutral protease of were as follows:the ratio of material to water for 1∶2,pH=6.0,temperature 40 ℃,time of 2 h,enzyme dosage 6000 u/mL.Optimum condition of alkaline protease were as follows:the ratio of material to water for 1∶2,pH=8.0,temperature 50 ℃,time 4 h,enzyme dosage 6000 u/mL. Composite enzymatic hydrolysis anticoagulant activity was higher than by mixed enzymatic hydrolysis. The highest anticoagulant activity was 52 ATU/mL. Conclusion:In the experimental conditions,the degree and anticoagulant activity by composite enzymatic hydrolysis were higher than by mixed enzymatic hydrolysis. The enzymatic hydrolysis solution,which was prepared by the enzyme combination of the composite enzyme of neutral protease and papain protease and alkaline protease,had the highest anticoagulant activity,was 52.0 ATU/mL.

buffalo milk;mixed enzymolysis;composite enzymolysis;anticoagulant activity;anticoagulant peptide

2016-12-06

苗艳丽(1978-),女,博士,副教授,研究方向:中药新产品的开发,E-mail:myl9831@163.com。

*通讯作者:陈绍红(1973),女,本科,高级实验师,研究方向:生物医药研发,E-mail:csh3788@163.com。 张兆霞(1968-),女,本科,高级实验师,研究方向:资源综合利用,E-mail:zhangzx2383300@126.com。

广东省教育厅2015年重点平台及科研项目(2015KTSCX057);广东海洋大学创新强校项目(GDOU2015050209);广东海洋大学2015年度大学生创新创业训练计划项目(CXXL2015030)。

TS252

A

1002-0306(2017)13-0107-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.13.020