杨晓青，黄岩杰，吕伟刚，李 静，毕亮亮，梅晓峰，李金刚

层粘连蛋白α2亚链在膜性肾病肾小球基膜的异常分布

杨晓青，黄岩杰，吕伟刚，李 静，毕亮亮，梅晓峰，李金刚

目的 观察Ⅳ型胶原和层粘连蛋白(laminin)亚链在膜性肾病(membranous nephropathy, MN)肾小球基膜(glomerular basement membrane, GBM)中的异常分布。方法 收集52例MN肾组织，按照Ehrenreich和Churg提出的基于电镜形态特征的分期方法进行分期，同时收集10例微小病变肾组织作为正常GBM的对照。采用间接免疫荧光法检测不同分期MN肾组织GBM正常存在的代表性α5(Ⅳ)链及laminin α5、β2链的分布形态，以及可能异常存在的laminin α2、β1链的表达。结果 在微小病变肾组织中α5(Ⅳ)链、laminin α5和β2链均沿GBM呈连续线状阳性；laminin α2、β1链在GBM中无表达。在Ⅰ期MN肾组织中α5(Ⅳ)链、laminin α5和β2链均呈连续线状表达。Ⅱ期MN肾组织中α5(Ⅳ)链在连续线状表达基础上形成大量钉突；laminin α5、β2链表达不规则增多，节段在连续线状表达基础上形成钉突。在Ⅲ期MN肾组织中α5(Ⅳ)链表达不规则增多，节段双轨状表达；laminin α5、β2链表达不规则增多，节段双轨、链环状表达。laminin α2链在Ⅰ期MN肾组织GBM未见明显阳性表达；在Ⅱ期和Ⅲ期MN肾组织GBM呈颗粒状阳性。laminin β1链在各期MN肾组织GBM均未见明显阳性表达。结论 MN患者GBM增厚不仅源自GBM固有Ⅳ型胶原亚链和laminin同种型的表达增多，还有正常仅表达于肾小球系膜区的laminin α2链的参与。

膜性肾病；层粘连蛋白α2；肾小球基膜

膜性肾病(membranous nephropathy, MN)是最常见的肾小球疾病，占我国成人原发性肾小球疾病的29.35%[1]、儿童肾活检总数的7.27%[2]，并逐年增高，在过去的10年中发病率增加了一倍。MN主要病变是肾小球上皮细胞下、基膜外侧有免疫复合物沉积，肾小球毛细血管基膜(glomerular basement membrane, GBM)高度均匀一致性增厚，可形成钉突、双轨、链环状结构。MN GBM增厚源于基膜样物质在上皮下免疫沉积物之间或周围沉积，多年来，研究者一直在对沉积的基膜样物质的成分进行研究，但是随着人们对细胞外基质成分，尤其是Ⅳ型胶原亚链和层粘连蛋白(laminin)同种型认识的深入，目前尚无明确的定论。Ⅳ型胶原和laminin是构成GBM的主要支架，各自形成网络结构。Ⅳ型胶原至少包括6条α亚链，分别命名为α1(Ⅳ)～α6(Ⅳ)链[3]。laminin包括15种不同的同种型，由α、β、γ三种不同的多肽链亚型组合成三聚体[4]。Ⅳ型胶原和laminin亚链在肾小球的分布存在位置特异性。本实验通过检测不同分期MN肾组织GBM正常存在的代表性α5(Ⅳ)链及laminin α5、β2链的表达，以及可能异常存在的laminin α2、β1链的表达，以明确MN肾小球基膜增厚形成钉突和链环状结构的组分。

1 材料与方法

1.1 材料 收集2016年1月～6月河南中医学院第一附属医院肾脏病理实验室经肾活检明确诊断的特发性MN 52例。按照Ehrenreich和Churg提出的基于电镜形态特征的分期方法[5]进行分期，其中：Ⅰ期MN 32例，Ⅱ期MN 15例，Ⅲ期MN 5例。同时收集10例肾小球微小病变肾组织作为正常对照GBM。

1.2 方法

1.2.1 肾脏病理检查 肾穿刺标本经10%中性福尔马林固定、石蜡包埋，2 μm厚切片，行常规染色(HE、PAS、Masson及PASM-Masson)观察，间接免疫荧光法检测PLA2R表达。肾组织冷冻切片厚3 μm，采用直接免疫荧光法检测常规免疫标记(IgA、IgG、IgM、C3、C4、CIq及纤维蛋白原)及IgG亚型表达。戊二醛固定肾组织常规透射电镜检查。

1.2.2 石蜡切片间接免疫荧光法检测肾组织α5(Ⅳ)链及laminin β2链表达 肾穿刺组织石蜡切片3 μm厚，常规脱蜡至水，抗原修复(pH 6.0枸橼酸高温高压修复5 min，然后滴加胃蛋白酶消化10 min)，分别滴加鼠抗人单克隆α5(Ⅳ)抗体(瑞典Wieslab公司，稀释度为1 ∶50)和鼠抗人单克隆laminin β2链抗体(美国Hybridoma Bank公司，稀释度为1 ∶100)，37 ℃孵育2 h，PBS清洗；滴加FITC标记羊抗鼠二抗37 ℃孵育30 min；甘油封片；显微镜观察。每例标本采集10个连续的肾小球，用Image Pro-Plus Software软件计算平均积分光密度(integrated optical density, IOD)值。

1.2.3 冷冻切片间接免疫荧光法检测肾组织laminin α2、a5、β1链表达 肾穿刺组织5 μm厚切片，常规冷丙酮固定10 min，分别滴加鼠抗人单克隆laminin α2、α5、β1链抗体(稀释度为1 ∶100，美国Chemicon公司)，37 ℃孵育2 h，PBS清洗；滴加FITC标记羊抗鼠二抗37 ℃孵育30 min；甘油封片；显微镜观察。采集每例标本冷冻切片上所有肾小球，用Image Pro-Plus Software 软件计算IOD值。

2 结果

2.1 α5(Ⅳ)链在肾组织GBM中的表达 α5(Ⅳ)链在肾小球微小病变肾组织GBM上呈连续线状阳性。α5(Ⅳ)链在Ⅰ～Ⅲ期MN肾组织GBM中的表达分别对应于光镜下GBM的形态变化，Ⅰ期MN呈连续线状表达；Ⅱ期MN呈连续线状表达基础上形成大量钉突；Ⅲ期MN表达不规则，节段双轨状表达(图1)。半定量分析显示α5(Ⅳ)链在Ⅱ期和Ⅲ期MN肾组织中的表达比微小病变和Ⅰ期MN肾组织明显增加，差异有显著性(P<0.01，表1)。

2.2 laminin亚链在肾组织GBM中的表达 laminin α5、β2链在肾小球微小病变肾组织GBM中均呈连续线状表达；laminin α2、β1链在肾小球微小病变肾组织GBM中无表达。laminin α5、β2链在Ⅰ期MN中均呈连续线状表达；在Ⅱ期MN表达不规则增多，节段在连续线状表达基础上形成钉突；在Ⅲ期MN表达亦不规则增多，节段呈双轨、链环状表达。laminin α2链在Ⅰ期MN肾组织GBM未见明显阳性表达，laminin α2链在Ⅱ期和Ⅲ期MN肾组织GBM呈颗粒状阳性表达。laminin β1链在各期MN肾组织GBM中均未见明显阳性表达(图2)。半定量分析显示laminin α5、β2链在Ⅱ期和Ⅲ期MN肾组织中的表达比微小病变和Ⅰ期MN肾组织明显增加，差异有显著统计学意义(P<0.01，表1)。

ABCDEF

图1 α5(Ⅳ)链在MN肾组织GBM中的表达：A.α5(Ⅳ)链在Ⅰ期MN肾组织GBM呈连续线状表达；B.α5(Ⅳ)链在Ⅱ期MN肾组织GBM呈连续线状表达基础上形成大量钉突；C.α5(Ⅳ)链在Ⅲ期MN肾组织GBM表达不规则，节段双轨状表达；D.Ⅰ期MN肾组织GBM呈连续线状，未见明显增厚；E.Ⅱ期MN肾组织GBM增厚，可见大量钉突形成；F.Ⅲ期MN肾组织GBM不规则增厚，可见双轨、链环状结构，免疫荧光和PASM-Masson染色

表1 α5(Ⅳ)链和laminin亚链在GBM中表达的半定量分析

3 讨论

GBM有独特的Ⅳ型胶原、laminin同种型组分，因而与其它基膜不同，有特征性的电荷和大小选择特性。MN肾小球毛细血管基膜增厚源于基膜样物质在上皮下免疫沉积物之间或周围沉积。本实验显示，在MNⅠ期未见GBM固有成分α5(Ⅳ)链、laminin α5和β2链表达增多；随着MN分期进展到Ⅱ期、Ⅲ期，钉突、双轨形成，固有的GBM成分α5(Ⅳ)链、laminin α5和β2链表达增多，参与钉突和双轨的形成，与相关的α5(Ⅳ)链研究表达结果一致[6]。这些研究结果提示，早期MN免疫复合物在上皮侧沉积未能刺激足细胞分泌多的α5(Ⅳ)链、laminin α5和β2链，随着免疫复合物沉积的不断增多，刺激足细胞分泌Ⅳ型胶原和laminin分割和包绕免疫复合物导致GBM增厚、钉突形成。作者长期病理形态学观察发现，在所有MN病例光镜下可见到足细胞肥大、电镜下可见到足细胞足突广泛融合。

此外，本实验在进展期MN检测到正常情况下仅存在于肾小球系膜区的laminin α2链在GBM上颗粒状表达。Setty等[7]的研究检测了5例特发性MN肾组织laminin α2、α5和β2表达，发现GBM正常组分α5和β2链表达的增多，未检测到laminin α2表达，与本实验研究结果不一致，可能与两项研究所用抗体生成厂家不同，针对的抗原表位不同有关。其他几项有关MN laminin表达的研究[8-9]未做laminin α2表达检测。Alport综合征是另一以GBM不规则增厚、撕裂为病理特征的肾脏疾病。Kashtan等[10]研究显示不论人类，还是犬类、鼠类Alport综合征均可见正常仅表达于肾小球系膜区的laminin α2链(与本研究所用抗体相同)在GBM中表达。

ABCDEF

图2 laminin亚链在MN肾组织GBM中的表达：A.laminin α5链在Ⅰ期MN肾组织GBM呈连续线状表达；B.laminin α5链在Ⅱ期MN肾组织GBM不规则颗粒状表达增多；C.laminin β2链在Ⅱ期MN肾组织GBM不规则颗粒状表达增多，节段在线状基础上形成钉突；D.laminin β2链在Ⅲ期MN肾组织GBM不规则颗粒状表达增多，节段呈双轨、链环状；E.laminin α2链在Ⅱ期MN肾组织GBM呈颗粒状表达；F.laminin β1在MN肾组织GBM阴性，免疫荧光

laminin α2链在增厚的GBM沉积的结构和功能意义尚不清楚，但是其增加了MN GBM增厚的结构成分谱。GBM的筛选特性取决于精确的laminin同种型组成，GBM新出现的laminin同种型可能通过改变GBM的孔径屏障或GBM与足细胞的相互作用在蛋白尿的发生中起作用。Zallocchi等[11]通过对Alport综合征患者、小鼠模型及CD151基因敲除小鼠的研究提示沉积在GBM的laminin α2链可能源自系膜侵入毛细血管袢的丝状伪足。此外，该实验组的体内、外实验结果显示laminin α2链能激活位于GBM外侧的足细胞表达局灶黏附激酶(focal adhesion kinase, FAK)[12]，以及下续的足细胞MMP-9、MMP-10和MMP-12表达增加导致GBM损伤。本组前期实验[13]显示，以GBM病变为主的MN和Alport综合征患者肾组织均见肾小球足细胞MMP-9表达增多，可能与异常沉积在GBM的laminin α2链刺激足细胞FAK表达有关。

Fischer等[9]的研究显示MN GBM出现正常仅在胚胎期表达的laminin β1。本实验在各期MN肾组织中均未检测到laminin β1在GBM表达。Kashtan等[10]的研究也未在人类Alport综合征GBM看到laminin β1链表达，尽管在犬类、鼠类Alport综合征GBM可看到局灶laminin β1链表达。

综上所述，MN患者GBM增厚不仅源自GBM固有Ⅳ型胶原亚链和laminin同种型的表达增多，还有正常仅表达于肾小球系膜区的laminin α2链参与。laminin α2链的表达异常不仅丰富了MN患者GBM增厚的结构成分，也可能进一步参与GBM外侧足细胞蛋白的表达异常，有待后续进一步深入探讨。

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Abnormal distribution of laminin α2 chain in glomerular basement membrane in membranous nephropathy

YANG Xiao-qing, HUANG Yan-jie, LÜ Wei-gang, LI Jing, BI Liang-liang, MEI Xiao-feng, LI Jin-gang
(LaboratoryofRenalPathology,theFirstAffiliatedHospitalofHenanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Zhengzhou450000,China)

Purpose To study the abnormal distribution of type Ⅳ collagen and laminin chains in glomerular basement membrane (GBM) in membranous nephropathy (MN). Methods 52 cases of MN were collected and staged according to electron microscopic morphological characteristics，and 10 cases of kidney tissues of minimal change disease were used as normal GBM control. Distribution pattern of α5(Ⅳ) chain, laminin α5 and β2 chains, and laminin α2 and β1 chains were detected using immunofluorescence method. Results In minimal change disease, α5(Ⅳ) chain, laminin α5 and β2 chains all showed continuously linear positive expression along GBM, and laminin α2 and β1 chains were negatively expressed in GBM. In stage Ⅰ MN, α5(Ⅳ) chain, laminin α5 and β2 chains all showed continuous linear positive expression along GBM. In stage Ⅱ MN, the expression of α5(Ⅳ) chain was increased and showed abundant spikes on the basis of continuous linear positive staining along GBM, and the expression of laminin α5 and β2 chains was increased，and segmental spikes were seen on the basis of continuous linear positive staining along GBM. In stage Ⅲ MN, the expression of α5(Ⅳ), laminin α5 and β2 chains was also enhanced and segmental double tracks were seen. The expression of laminin α2 chain was negative in GBM in stage Ⅰ MN, but granular positive expression along GBM was seen in stage Ⅱ and stage Ⅲ MN. No positive expression of laminin β1 chain was seen in GBM in different stages in MN. Conclusion The GBM thickness in MN originates not only from intrinsic type Ⅳ collagen chains and laminin chains, but also from laminin α2 chain, which only exist in glomerulus mesangium in normal condition.

membranous nephropathy; laminin α2; glomerular basement membrane

河南省郑州市普通科技攻关计划(153PKJGG170)、河南省科技创新杰出青年科技计划(144100510014)

河南中医药大学第一附属医院肾脏病理实验室，郑州 450000

杨晓青，女，硕士，主治医师。E-mail: yxqljy@163.com 黄岩杰，女，教授，主任医师，硕士生导师，通讯作者。 E-mail: huangyanjie69@163.com

时间：2017-6-20 11:18 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170620.1117.009.html

R 692

A

1001-7399(2017)06-0636-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.06.009

接受日期：2017-03-13