马文文 刁恩杰 李向阳 董海洲 陈 宁

(山东农业大学食品科学与工程学院1，泰安 271018) (山东金胜粮油集团2，临沂 276600)

改性蒙脱土脱除花生油中黄曲霉毒素B1条件优化研究

马文文1刁恩杰1李向阳1董海洲1陈 宁2

(山东农业大学食品科学与工程学院1，泰安 271018) (山东金胜粮油集团2，临沂 276600)

为了提高钠基蒙脱土(Na-MMT)脱除花生油中黄曲霉毒素B1(AFB1)的效率，本试验以Na-MMT为原料，选用6种有机季铵盐作为改性剂对其进行改性，并利用响应面法对改性Na-MMT脱除花生油中AFB1的条件进行优化。结果表明，改性Na-MMT脱毒效果显著优于未改性Na-MMT(P<0.05)；在6种改性剂中，十八烷基三甲基氯化铵(1831)改性后的Na-MMT脱毒效果显著优于其他5种改性剂(P<0.05)，且在添加量为20% CEC(Na-MMT阳离子交换能力)改性的Na-MMT吸附脱除花生油中AFB1效果最好。分别以吸附时间、吸附温度、改性吸附剂添加量为因素进行响应面优化，得到最佳吸附温度为53.79 ℃、吸附剂添加量为3.13%、吸附时间为29.46 min；在此条件下，花生油中AFB1含量从(29.20±2.12)μg/kg降低到(4.47±0.29)μg/kg，脱毒率为84.69%。有机改性能有效提高Na-MMT吸附脱除花生油中AFB1的效果，可在花生油加工企业推广应用，以提高油的食用安全性。

有机改性蒙脱土 吸附脱毒 黄曲霉毒素B1响应面 花生油

花生油营养价值高、口感好、香味浓，因此受到我国及亚洲各国消费者的喜爱。然而，我国很多地区生产的花生油经常被检测出含有黄曲霉毒素B1(AFB1)，特别是我国南方地区生产的花生油中AFB1含量超出我国限量要求(20 μg/kg)的几十倍[1-2]。AFB1是一种真菌毒素，人和动物经常食用污染AFB1的食物可能会导致急性或慢性中毒，如急性肝损伤、坏死、甚至是肝癌[3-4]。由于花生油是我国居民消费的主要食用油之一，经常食用AFB1污染的花生油，可能会使我国居民慢性中毒或患肝癌的几率明显增加。

自从人类发现黄曲霉毒素以来，一直在探寻有效预防和脱除食物中黄曲霉毒素的方法，经常研究和使用的方法包括物理法、化学法和生物法[5-7]。物理吸附法常用于脱除玉米、花生粕等饲料原料中污染的黄曲霉毒素，但在食品中应用报道较少[8]。在油脂精炼环节，经常用蒙脱土进行油脂脱色，同时可部分吸附去除花生油中的黄曲霉毒素。但是，蒙脱土是一种亲水性的硅酸盐类矿物，在前期的试验研究中，发现其在油脂中的分散性差，容易聚团，不能与油脂充分混合，进而导致其在油脂中分布不均匀，吸附脱毒效果差。本研究通过6种有机季铵盐对蒙脱土进行改性，提高蒙脱土的亲油性、增加其层间距，以期提高蒙脱土对花生油中AFB1的吸附脱除率，同时对改性蒙脱土的吸附脱毒条件进行优化。

1 材料与方法

1.1 材料

钠基蒙脱土(Na-MMT)：青岛玉洲化工有限公司，纯度99%，阳离子交换容量(CEC):pH 7.6，139 mmol/100 g，不含氯离子；花生油：自榨，AFB1含量为(29.20±2.12)μg/kg；季铵盐改性剂见表1，均为分析纯：上海金山经纬化工有限公司；AFB1标准品(分子式C17H12O6，分子质量312.27)，纯度大于98%：上海生物工程有限公司。

表1 改性剂种类、结构和分子质量

1.2 主要仪器设备

TGF-1榨油机：东莞天工坊有限公司；LC-20AT高效液相色谱：日本岛津公司；VORTEX KB-3涡旋混合仪：海门市其林贝尔仪器制造有限公司；UGC-12W氮吹仪：北京优晟联合科技有限公司；TG1650-WS离心机,上海卢湘仪离心仪器有限公司；DFT-50粉碎机：温岭市林大机械有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 花生油中AFB1测定[5]

称取5.0 g油样，加入15.0 mL甲醇水溶液(甲醇∶水=70∶30)，用力振摇1 min，滤纸过滤后取4 mL滤液，加入2 mL石油醚，振摇静置分层后，取底部3 mL提取液加入8 mL蒸馏水稀释、混合，并通过0.45 μm有机滤膜，净化后通过免疫亲和柱。被洗脱的样品加入三氟乙酸在40 ℃下衍生20 min，样品中剩余的甲醇和三氟乙酸经过氮吹仪吹干后，用乙腈水(乙腈∶水=15∶85)振荡溶解后进行高效液相色谱分析。

液相色谱进样条件：色谱柱：Kromasil 100-5 C18 150 mm×4.6 mm；乙腈-水二元梯度洗脱条件：15%乙腈洗脱6 min，17%乙腈洗脱2 min，25%乙腈洗脱6 min，15%乙腈洗脱8 min，85%乙腈洗脱4 min，15%乙腈洗脱3 min；荧光检测器进行检测(λ激发=360 nm，λ发射=440 nm)；流速：1 mL/min；进样量10 μL。

1.3.2 蒙脱土有机改性及改性剂选择

1.3.2.1 Na-MMT的改性

称取20 g Na-MMT于400 mL去离子水中，置于60 ℃水浴中，在200 r/min下搅拌2 h，得到蒙脱土悬浮液。按Na-MMT阳离子交换量(CEC)的40%在悬浮液中分别加入溶解的1831(3.87 g)、D1821(6.52 g)、1827(4.71 g)、1631(3.56 g)、1227(3.78 g)及1231(2.94 g)，于60 ℃水浴中搅拌5 h(200 r/min)。经离心、清洗至上清液无氯离子存在，然后放入80 ℃的烘箱中烘干，冷却，粉碎后过200目筛，密封并分别标记为M1831、MD1821、M1827、M1631、M1227和M1231，保存备用。

1.3.2.2 有机改性剂选择

分别取25 g花生油倒入6个100 mL烧杯中，分别加入花生油量的1%(质量比)6种改性Na-MMT，未改性Na-MMT做对照，在35 ℃、150 r/min条件下搅拌吸附60 min，于5 000 r/min离心，提取油样按照1.3.1步骤分离、纯化并测定AFB1残留量。

筛选出吸附效果最好的Na-MMT改性剂，按照Na-MMT阳离子交换量(CEC)的5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%对其进行梯度改性，方法同1.3.2.1，再确定有机改性剂的最佳添加量。

1.3.3 改性蒙脱土对花生油中AFB1吸附脱毒条件优化

1.3.3.1 吸附剂添加量的影响

分别在2组盛有25 g花生油的烧杯中加入1%、2%、3%、4%、5% Na-MMT和改性Na-MMT，在35 ℃、150 r/min条件下搅拌吸附60 min后，于5 000 r/min离心，提取油样按照1.3.1步骤分离、纯化并测定AFB1残留量。

1.3.3.2 吸附时间的影响

分别在2组盛有25 g花生油烧杯中加入3% Na-MMT和改性Na-MMT，在35 ℃、150 r/min条件下分别搅拌吸附15、30、45、60、75 min后，于5 000 r/min离心，提取油样按照1.3.1步骤分离、纯化并测定AFB1残留量。

1.3.3.3 吸附温度的影响

分别在2组盛有25 g花生油烧杯中加入3% Na-MMT和改性Na-MMT，分别在35、45、55、65、75 ℃恒温水浴中搅拌吸附30 min(搅拌速度150 r/min)，于5 000 r/min离心，提取油样按照1.3.1步骤分离、纯化并测定AFB1残留量。

1.3.3.4 响应面法优化花生油中AFB1吸附脱毒条件

根据上述单因素试验的测定结果，运用Box-Behnken中心组合试验的设计原理设计响应面试验。以吸附温度(A)、吸附时间(B)、M1831添加量(C)为变量，进行三因素三水平的响应面试验，试验设计见表2。采用Design-Expert 8软件进行方差分析以评价模型的统计意义。

表2 Box-Behnken设计试验

1.4 统计分析

每组试验均进行3次重复，并采用SPSS 18.0软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 有机改性剂的选择

Na-MMT是一种亲水性的硅酸盐，在油中存在分散性差、分布不均匀等缺陷，从而降低了其吸附脱除油中AFB1的能力。本研究选用6种有机季铵盐，即十八烷基三甲基氯化铵(1831)、十八烷基二甲基苄基氯化铵(1827)、双十八烷基二甲基氯化铵(D1821)、十六烷基三甲基氯化铵(1631)、十二烷基二甲基苄基氯化铵(1227)和十二烷基三甲基氯化铵(1231)分别对Na-MMT进行改性，结果见图1。

注：字母不同表示数据间存在显著差异(P<0.05)，下同。图1 不同改性剂对Na-MMT吸附脱除花生油中AFB1效果的影响

从图1可以看出，6种有机改性剂均能显著提高Na-MMT的吸附脱毒效果(P<0.01),经改性Na-MMT吸附脱毒后的花生油中AFB1从(29.20±2.12)μg/kg分别减少到(13.44±0.63)μg/kg(M1231)、(13.95±1.08)μg/kg(M1227)、(12.82±0.99)μg/kg(M1631)、(14.30±0.38)μg/kg(MD1821)、(12.58±0.98)μg/kg(M1827)和(12.00±1.09)μg/kg(M1831)，吸附脱毒效果均显著高于未改性的Na-MMT(15.55±0.55 μg/kg)(P<0.05)。由于所用季铵盐均为阳离子表面活性剂，改性后的Na-MMT亲油性增强，因此，在试验过程中发现改性后的Na-MMT在花生油中的分散性得到明显改善、聚团减少，提高了与花生油的接触面积和混合均匀度，进而提高了其对花生油中AFB1的吸附脱除效果。另外，有机季铵盐阳离子的分子直径远远大于钠离子，通过离子交换置换下Na-MMT层间的钠离子，从而增大了Na-MMT的层间距，季铵盐碳链越长，改性后的Na-MMT片层间距越大(图2)，在一定程度上层间距的增大有利于提高其对AFB1吸附能力[9-10]。

图2 Na-MMT与6种改性Na-MMT的XRD图谱(40% CEC)

在6种季铵盐改性剂中，1831改性后的Na-MMT吸附脱毒效果最好，其分子质量大小位于6种季铵盐中间(见表1)，这说明季铵盐改性剂分子质量的大小与改性Na-MMT吸附脱毒效果密切相关，改性剂分子量太大或太小都会降低改性Na-MMT的吸附脱毒效果，其原因有待进一步研究。另外，D1821改性的Na-MMT的吸附脱毒效果最差，这可能是由于D1821的分子结构与分子质量决定的，既D1821为双链烷基结构，其长链进入Na-MMT片层虽增加了片层间距，但也占据了较多的片层空间，阻碍了AFB1分子进入片层(表1)。因此，本试验选用1831作为改性剂做进一步的研究。

2.2 改性剂1831添加量的确定

为确定1831改性剂最佳添加量，本试验按照Na-MMT阳离子交换能力(CEC)的5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%的量添加到Na-MMT悬浮液中进行改性，结果见图3。图3表明，随着改性剂添加量的增加，改性Na-MMT的吸附脱除花生油中AFB1的能力先增加后降低，在20%CEC添加量时，吸附脱毒效果达到最高，花生油中AFB1残留量由(29.20±2.12)μg/kg显著降低到(8.86±0.69)μg/kg(P<0.05)，减少了69.66%，而未改性的Na-MMT降低到(15.55±0.55)μg/kg，仅减少了46.75%。当1831添加量低于20%CEC时，随着改性剂添加量的增加，有利于提高Na-MMT亲油性和层间距，进而提高其吸附脱除AFB1的性能；而当1831添加量超过20%CEC时，改性Na-MMT吸附脱除AFB1的能力显著降低(P<0.05)，这可能是由于改性剂过多插入到Na-MMT的片层间，占据了较多的AFB1吸附活性位点，降低了本身的阳离子交换能力所致[10-11]。另外，过多的改性剂也可能进入Na-MMT片层间的空隙，阻碍了AFB1分子进入，进而降低了Na-MMT吸附脱毒效果。因此1831的添加量选择在20% CEC Na-MMT当量。

图3 1831添加量对Na-MMT吸附脱除花生油中AFB1效果的影响

2.3 改性蒙脱土(M1831)吸附脱毒条件优化

2.3.1 M1831添加量对脱除花生油中AFB1效果的影响

改性前后Na-MMT添加量对花生油中AFB1吸附脱毒效果见图4。

注：大小写字母不同分别表示Na-MMT和M1831添加量不同引起的吸附脱毒效果存在显著差异，“**”表示在相同添加量条件下Na-MMT和M1831吸附脱毒效果存在极显著差异(P<0.01)，“*”表示存在显著差异(P<0.05)，下同。图4 改性前后Na-MMT添加量对花生油中AFB1吸附脱毒效果的影响

由图4得出，改性前后的Na-MMT均能有效吸附脱除花生油中残留的AFB1(P<0.01)，且随着吸附剂添加量的增加，油中AFB1脱除效果越好。当吸附剂添加量为3%时，花生油中残留的AFB1从(29.20±2.12)μg/kg分别降低到(9.09±0.50)μg/kg(Na-MMT)和(6.91±0.46)μg/kg(M1831)，分别减少了68.87%(Na-MMT)和76.34%(M1831)。当添加量超过3%时，Na-MMT和M1831都不能显著降低油中AFB1残留量(P>0.05)。与Na-MMT吸附脱毒效果相比，M1831吸附脱毒效果得到极显著提高(P<0.01)。

2.3.2 吸附时间对脱除花生油中AFB1效果的影响

吸附时间对改性前后Na-MMT吸附脱除花生油中AFB1的效果见图5。由图5可得出，在设定的吸附时间内，改性前后的Na-MMT均能显著降低花生油中的AFB1残留量(P<0.01)。在相同的吸附时间时，M1831的吸附脱毒率显著高于Na-MMT(P<0.05)。Na-MMT在吸附时间45 min时，吸附脱毒率达到最大值为73.15%，而M1831在吸附时间30 min时达到最大值为79.56%，因此改性后的Na-MMT能明显减少对花生油中AFB1的吸附脱除时间，这与改性后Na-MMT亲油性增强[12]，更容易分散到油中与油充分混合有关。当Na-MMT和M1831吸附时间分别超过45、30 min后，油中AFB1吸附脱毒率有下降的的趋势，这可能是因为随着吸附时间的增加，吸附剂表面吸附的AFB1发生解析，在吸附搅拌的作用下AFB1分子挣脱吸附表面能而重新释放到油中[13]。

图5 吸附时间对花生油中AFB1吸附脱毒效果的影响

2.3.3 吸附温度对脱除花生油中AFB1效果的影响

吸附温度对改性前后Na-MMT吸附脱除花生油中AFB1的效果见图6。由图6可得出，在设定的吸附温度内，随着吸附温度的升高，Na-MMT和M1831吸附脱除花生油中AFB1的效果迅速增加，并分别在65、55 ℃时增加趋于平缓，此时油中AFB1脱除率分别达到79.32%和84.04%；当吸附温度超过55 ℃时，升高温度并不能显著提高Na-MMT和M1831的吸附脱毒率(P>0.05)，这是由于在温度低于55 ℃时，升高温度会提高吸附剂的吸附活性，增加油中AFB1分子运动速度，从而提高吸附剂的吸附脱毒能力；但继续升高温度，油中整个体系分子的运动速率继续加快，催化氧化、色素分解等多种反应进行[14]，干扰了AFB1与吸附剂的结合；另外，在吸附达到平衡时，继续升高温度，则有利于解吸过程的发生，从而导致吸附剂的吸附脱毒能力趋于平缓和稳定。

图6 吸附温度对花生油中AFB1吸附脱毒效果的影响

2.3.4 吸附脱除花生油中AFB1响应面优化试验

根据单因素试验结果进行响应面试验。以M1831添加量、吸附时间、吸附温度为变量，进行三因素三水平的响应面试验，试验结果如表3。

表3 Box-Behnken试验设计及结果

根据Box-Behnken响应面设计展开了17组试验，其中包括12个析因试验和5个中心试验(见表3)。由结果得出，吸附温度(A)、吸附时间(B)、M1831添加量(C)与AFB1残留量的二次多项回归方程为：

AFB1=4.48+0.26A+0.15B-0.18C-0.14AB+0.068AC+0.18BC+0.61A2+1.06B2+0.43C2

对回归模型进行显著性检验和方差分析，结果见表4。由表4可看出，本试验所建立的模型P<0.000 1,说明该模型的二次多项式回归拟合方程高度显著，不同处理间的差异极显著(P<0.01)。失拟项P=0.068 1>0.05说明在α=0.05水平上失拟项不显著，即该模型拟合度较好，应用该模型于吸附脱除花生油中AFB1的条件优化是可行的。

该模型三因素的P值均小于0.01，说明吸附温度、吸附时间及M1831添加量对吸附脱毒效果的影响极显著，其影响顺序为吸附温度>M1831添加量>吸附时间。3个因素的二次项P值均小于0.01，交互项AC不显著，AB显著，BC极显著，对油中AFB1残留量的影响并非线性关系，而是呈二次抛物面关系。

表4 回归模型的显著性检验及方差分析

注：**表示差异极显著，P<0.01；*表示差异显著，P<0.05。

根据回归方程，得出M1831吸附脱除花生油中AFB1的最佳条件为：吸附温度为53.79 ℃，M1831添加量为3.13%，吸附时间为29.46 min，预期得到的花生油中AFB1残留量从(29.20±2.12)μg/kg降低到(4.42±0.00)μg/kg。进一步对优化条件进行验证，得到吸附脱毒后的AFB1残留量从(29.20±2.12)μg/kg降低到(4.47±0.29)μg/kg，吸附脱毒率达到84.69%，与预期结果无显著差异(P>0.05)。吸附脱毒后的花生油中AFB1残留量低于GB 1534—2003对花生油中AFB1的限量要求(20 μg/kg)。

3 结论

有机季铵盐改性能显著提高Na-MMT对花生油中AFB1的吸附脱毒效果，6种有机季铵盐中1831改性后的Na-MMT吸附脱毒效果明显优于其他季铵盐，且在20%CEC添加量时改性效果最好。吸附温度、吸附时间和M1831添加量均显著影响花生油中AFB1的吸附脱毒效果，且吸附温度>M1831添加量>吸附时间。响应面法优化M1831吸附脱毒工艺为吸附温度53.79 ℃、时间29.46 min、M1831添加量3.13%，在该条件下可将花生油中AFB1残留量降低到(4.47±0.29)μg/kg，达到GB 1534—2003对花生油中AFB1的限量要求(20 μg/kg)。Na-MMT有机改性工艺及改性吸附剂的脱毒工艺可在花生油加工企业进行推广应用，以保障油的食用安全性。

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Optimization of Removing Aflatoxin B1in Peanut Oil by Modified Montmorillonite

Ma Wenwen1Diao Enjie1Li Xiangyang1Dong Haizhou1Chen Ning2

(College of Food Science & Engineering,Shandong Agricultural University1,Taian 271018) (Shandong Jinsheng Cereal & Oils Group2,Linyi 276600)

Na-montmorillonite(Na-MMT)was modified with six organic quaternary ammonium salts as modifiers for improving its detoxifying efficiency on Aflatoxin B1(AFB1)in peanut oil.The response surface method(RSM)was used to optimize the detoxifying conditions of AFB1in peanut oil with modified Na-MMT.The results showed that the modified Na-MMT were all significantly better than Na-MMT in detoxifying efficiency on AFB1in peanut oil(P<0.05).Among the six modifiers,the octadecyl trimethyl ammonium chloride(1831)was the best one in improving the detoxifying efficiency of Na-MMT(P<0.05).Na-MMT modified by 1831 with 20%CEC(cation exchange capacity of Na-MMT)of addition had the best detoxifying efficiency on AFB1in peanut oil.The adsorption time,adsorption temperature,and addition amount of modified Na-MMT were chosen to optimize the detoxifying conditions,and the optimum adsorption temperature was 53.79 ℃,the addition amount of modified Na-MMT was 3.13%,and the adsorption time was 29.46 min.Under the optimum detoxifying conditions,the AFB1in peanut oil could be removed from(29.20±2.12)μg/kg to(4.47±0.29)μg/kg with 84.69% of detoxification.Therefore,organically modified Na-MMT could significantly improve the detoxifying efficiency of AFB1in peanut oil,which could be popularized and applied in the peanut oil processing enterprises for improving the edible safety of oil.

organically modified montmorillonite,adsorption detoxification,aflatoxin B1，response surface method，peanut oil

公益性行业专项(201203037)，山东省自主创新及成果转化专项(2014ZZCX07204)，山东省高校科技发展计划(J14LE15)

2015-12-15

马文文，女，1988年出生，硕士，粮食、油脂与植物蛋白工程

刁恩杰，男，1977年出生，博士，粮油食品加工与质量控制 董海洲，男，1957年出生，教授，粮油食品加工与质量控制

TS210.4

A

1003-0174(2017)06-0139-07