袁方园，贾斌*，王绪海，杜迎春，孙丽蓉，李鑫，李亚强，沈文

（1石河子大学动物科技学院，新疆 石河子 832003；2水生野生动植物救护中心，北京 102100；3农畜产品质量安全中心，内蒙古 通辽 028000）

细粒棘球六钩蚴副肌球蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

袁方园1，贾斌1*，王绪海1，杜迎春2，孙丽蓉3，李鑫1，李亚强1，沈文1

（1石河子大学动物科技学院，新疆 石河子 832003；2水生野生动植物救护中心，北京 102100；3农畜产品质量安全中心，内蒙古 通辽 028000）

为了表达、纯化细粒棘球六钩蚴副肌球蛋白及制备多克隆抗体，本研究构建细粒棘球六钩蚴副肌球蛋白原核表达载体pET30a-M26，转化至大肠杆菌BL21(DE3)内进行诱导表达，SDS-PAGE切胶纯化的副肌球蛋白，免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体，并用Western blotting和ELISA对副肌球蛋白及抗体进行检测。结果显示：成功表达并纯化了细粒棘球六钩蚴副肌球蛋白，重组蛋白分子质量约41 kD，纯化后目的蛋白纯度可达85%，蛋白浓度为0.5mg/ml。副肌球蛋白可与所制备的多克隆抗体结合，ELISA测定的抗体效价为1∶12800，结果表明，成功表达并纯化了六钩蚴副肌球蛋白。本研究可为研究包虫病早期诊断奠定了基础。

副肌球蛋白；原核表达；多克隆抗体；六钩蚴

由于细粒棘球蚴病原对外界环境条件的高度抵抗力及其传播的复杂性，目前这一疾病尚未得到完全有效的控制［1］，而且包虫病是一种慢性寄生虫病，不仅给畜牧业和食品工业造成严重的经济损失，亦严重威胁人类健康。目前缺乏快速有效的早期诊断检测方法是畜牧业发展的一大问题，而早期诊断可以在病原感染早期发现此病并采取治疗措施。1988年Pearce等［2］利用亲和层析法从曼氏血吸虫可溶性成虫抗原(SWAP)获得副肌球蛋白（PMY），将其作为疫苗进行定量研究，并初步阐明其细胞免疫机制。副肌球蛋白是扁形动物门寄生虫的主要抗原成分［3］，存在于虫体皮下、生殖道、消化道及部分寄生虫的体表，并可分泌到体外［4-5］，而且能与动物和人的IgG抗体Fc片段结合［6］，对补体介导的免疫反应有抑制作用，能够引起较强的免疫反应，已被选作多种寄生虫疫苗的候选抗原［7-8］。血清中副肌球蛋白的检测可用于预测包虫病感染早期，如果能在家畜上利用M26检测六钩蚴，将有利于及时采取治疗措施，降低病死率，提高经济效益，将对畜牧业有重要的意义。

Shustov等［9］对猫后睾吸虫副肌球蛋白序列进行了测定，成功构建了对应于猫后睾吸虫副肌球蛋白中间区域的原核表达载体。免疫印迹分析表明，鼠抗多肽超免血清能成功地结合猫后睾吸虫提取物中的天然副肌球蛋白。由于真核表达相比原核表达最大的问题就是表达后的纯化问题，一般上清表达量极低，只能得到很少的蛋白，仅适合用于功能性研究，而后者简便快捷，表达量大，适用于做抗体。因此，本研究构建原核表达载体pET30a-M26，以制备出效价较高的多克隆抗体，以期为包虫病的早期诊断提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

六钩蚴来自新疆石河子大学动物科技学院基础实验室，15只6-8周龄雌性SPF级Balb/c小鼠购自石河子大学实验动物中心。

1.1.2 主要试剂

Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、限制性核酸内切酶、pMD19-T、即用型蛋白质 Maker(Premixed Protein Maker)均购自TaKaRa公司；大肠杆菌克隆菌株DH5α、表达菌株 BL21均购自宝生物工程(大连)有限公司；离心柱型质粒小量提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、HRP-羊抗兔抗体均购自北京天根生化科技有限公司；Page Ruler预染蛋白质Marker(Page Ruler Prestained Protein Ladder Marker)购自赛默飞世尔科技 (中国)有限公司；原核表达质粒pET-30a由石河子大学基础兽医学实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 基因合成

根据Uniprot提供的细粒棘球六钩蚴副肌球蛋白(M26)的核酸序列(登录号：Q56J94)，由北京华大蛋白对基因进行评估，将每个氨基酸第3个碱基部分优化，保证氨基酸不变，上下游分别加入EcoRI(GAATTC)和 XhoI(CTCGAG)酶切位点(阴影部分)，目的基因长度为912 bp。

1.2.2 目的基因连接、转化及序列测定

将目的基因与pMD19-T连接，16℃过夜；按照感受态大肠杆菌DH5a的操作说明，将连接产物导入DH5a；复苏、抹板，37℃ 倒置培养过夜；挑取单个克隆菌落，肉汤中扩大培养；用菌液作模板进行菌落PCR鉴定，PCR鉴定为阳性的菌液送到北京华大基因股份有限公司测序，命名为pMD19-T-M26。

1.2.3 副肌球蛋白基因片段原核表达载体的构建

1.2.3.1 连接产物的双酶切

选择1.2.2中测序正确的菌液，抽提质粒。选择EcoRI和SmaI进行双酶切，酶切的条件参照不同限制性内切酶的操作说明；酶切产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳，切胶目的片段，参照DNA凝胶回收试剂盒操作说明，纯化回收酶切产物。

1.2.3.2 pET30a expression vector的双酶切

将pET30a expressionvector按常规方法转入DH5a，复苏、抹板、扩大培养，抽提质粒；对质粒进行双酶切，选择EcoRI及SmaI内切酶，酶切产物的纯化操作方法同于1.2.1。

1.2.3.3 重组原核表达载体的鉴定

Expression vector的连接与转化参照 T4 DNA连接酶的操作说明，设定25 μL反应体系进行连接；按常规方法将连接产物转入DH5a，复苏、抹板、过夜培养。挑取数个单克隆扩大培养，PCR鉴定；取PCR阳性菌落抽提质粒，双酶切鉴定观察重组质粒内是否含有目的基因片段；PCR和双酶切鉴定均为阳性的质粒送由北京华大基因股份有限公司测序，重组质粒经测序验证命名为pET30a-M26。

1.2.4 重组蛋白的诱导表达

将pET30a-M26重组质粒通过热击法转化大肠杆菌表达菌株BL21，涂布LB固体培养基，37℃过夜培养，挑取单菌落接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃振荡培养4 h后取出2 μL菌液作为模板进行PCR扩增，反应体系与条件同1.2.2；将鉴定为阳性的表达菌送北京华大基因股份有限公司测序，测序结果与原始序列比对正确后，将阳性菌转化到平板上，挑单克隆到1.5 mL LB液体培养基中，37℃，200 r/min培养，培养至OD 0.6-0.8，IPTG(0.5 mmol/L)诱导，37 ℃，200 r/min 培养 2 h。取1 mL诱导的菌液，12000 r/min，离心1 min，弃上清，沉淀用50-100μL 10mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)溶液吹散(加入缓冲液的量视菌体量而定)，加入与缓冲液等体积的 2×loading buffer，100℃煮 5 min，电泳检测。接1-2 μL活化的菌液到10 mL LB液体培养基中，37℃培养，200 r/min。将培养的菌液转接到500 mL LB液体培养基中，37℃，200 r/min，培养至OD 0.6-0.8，IPTG(0.5 mmol/L)37 ℃诱导 4 h。收菌：6000 r/min，离心 5 min。弃上清。超声破菌：菌体用20-30 mL 10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)溶液吹散，超声波破碎(500 W，60次，每次 10 s，间隔15 s)。电泳确定表达形式：取100 μL超声后的菌悬液，12000 r/min，离心10 min，取50 μL上清至另一EP管，上清去除干净后沉淀用50 μL 10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)溶液吹散，电泳检测。

1.2.5 重组蛋白的纯化

用去离子水洗镍柱 (Ni Sepharose 6 Fast Flow，GE Healthcare)，至 pH 7.0。挂镍，至 pH 2.0-3.0。去离子水洗柱至pH 7.0。10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)溶液平衡镍柱，约100 mL。含0.5 mol/L氯化钠的10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)溶液平衡镍柱，约 50 ml。稀释样品上样。样品中含氯化钠，终浓度为0.5 mol/L。上样结束后，用含0.5 mol/L氯化钠的10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)溶液洗柱。分别用含15 mmol/L咪唑、60 mmol/L咪唑、300 mmol/L咪唑的10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)(含 0.5 mol/L 氯化钠)溶液洗脱，分别收集蛋白峰，电泳检测蛋白纯化效果。

1.2.6 抗细粒棘球六钩蚴副肌球蛋白多克隆抗体的制备

将400 μg纯化的重组蛋白，用生理盐水稀释到200-500 μL，与等量的弗氏完全佐剂混合，充分乳化后免疫新西兰大白兔，免疫之前耳静脉取阴性血清，1周后，将200 μg纯化的重组蛋白与等量的弗氏不完全佐剂混合进行加强免疫，共免疫3次，第3次免疫7 d后颈动脉取血，收集多抗血清。

1.2.7 ELISA方法测定小鼠抗体水平

使用包被缓冲液稀释纯化的重组蛋白浓度至100 μg/mL，取 100 μL 加入到 96孔酶标板中，4℃放置过夜。次日，弃掉多余的包被液，使用PBST洗板3次，每次3 min，洗后拍干，加入100 μL 5%脱脂奶粉，37℃ 封闭1 h，封闭结束后，甩掉封闭液，用PBST洗板3次，每次3min；重组蛋白免疫的新西兰大白兔血清和免疫前的新西兰大白兔血清分别按 1 ∶200、1 ∶400、1 ∶800、1 ∶1600、1 ∶3200、1 ∶6400、1 ∶12800、1∶25600、1∶51200、1∶102400 稀释，依次横向加入到96孔酶标板中，每孔100 μL，37℃作用1 h，作用结束后，用PBST洗板3次，每次3min；加入用PBST稀释的山羊抗兔IgG/HRP二抗(1∶20000)，37℃放置1 h，二抗作用结束后，用PBST洗板3次，每次3 min；加入100 μL的TMB底物溶液，避光显色10 min后，加入100 μL的终止液终止反应。酶标仪测定450 nm 波长的D值，分析抗体水平。

1.2.8 重组蛋白反应原性的Western blotting分析

纯化的重组蛋白经SDS-PAGE后，电转移至NC膜，经5%脱脂牛奶室温封闭1 h；加入TBST稀释的兔多抗血清(1∶1000稀释)，室温孵育 1 h；再加入HRP-羊抗兔抗体 (1∶5000稀释)，室温孵育1 h；加入HRP显色试剂，避光显色约1 min，至目的条带清晰后，加入去离子水终止显色。

2 结果与分析

2.1 重组质粒pET30a-M26的构建及鉴定

以重组质粒为模板，PCR扩增后用1.0% 琼脂糖凝胶电泳检测，与预期结果相符。用EcoRI和XhoI对重组质粒进行双酶切，用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测双酶切产物，在 4165和2141 bp处各有1条清晰的条带(图1)。测序结果（图2）显示，细粒棘球六钩蚴副肌球蛋白目的基因片段序列与Uniprot提供的细粒棘球六钩蚴副肌球蛋白的核酸序列(登录号：Q56J94)完全一致，未发生突变。

图1 重组质粒的双酶切鉴定结果Fig.1 Restriction enzyme identification results of recombinant plasmid

图2 重组质粒pET30a-M26测序结果Fig.2 Sequencing of the recombinant plasmid pET30a-M26

2.2 重组蛋白诱导表达及纯化

对诱导表达菌体的上清和沉淀进行12%SDS-PAGE分析，结果显示，pET30a-M26转化的菌株经IPTG诱导后在分子质量约41 kD处出现1条蛋白条带，目的蛋白主要分布在菌体上清中，沉淀即包涵体中的表达量较少(图3)。对菌体沉淀诱导小量表达进行12%SDS-PAGE分析，结果显示，小量有表达(图4)，表明插入pET30a的M26已经成功地在大肠杆菌中表达。而纯化的表达产物在分子质量约41 kD处显示出1条蛋白带(图5)。

图4 M26小量表达Fig.4 M26 small amount of expression

图5 重组蛋白纯化结果Fig.5 Purified result of the recombinant protein

2.3 新西兰大白兔抗体水平的测定结果

将免疫重组蛋白的新西兰大白兔血液3000 r/min离心10 min，吸出血清，进行大白兔抗体水平测定，按照预先设定的稀释梯度对抗血清进行稀释，进行ELISA测定，结果(图6)显示兔抗 M26多克隆抗体效价达到1:12800。

图6 新西兰大白兔多克隆抗体水平效价图Fig.6 Polyclonal antibody titer of rabbits

2.4 Western blotting检测结果

纯化的重组蛋白经Western blotting分析结果(图7)可见明显的单一印迹条带，这表明该蛋白能与兔多抗阳性血清发生特异性结合，具有较好的反应原性。

图7 纯化重组蛋白的Western blotting分析Fig.7 Western blotting analysis of purified recombinant protein

3 讨论

包虫病的诊断方式主要通过影像检测 (X线射片、CT、超声、MR、DSA/SCA)、皮内试验及血象分析。但这些方法多为后期诊断(即形成包囊后)，而且影像检测具有放射性，危害动物健康；皮内试验灵敏性强而特异性差，检测结果可能出现假阳性或交叉反应，以至于检测结果的准确性低并且耽误治疗。陈新华［10］等利用囊液抗原 (EgCF)、头节抗原(EgP)、半纯化的细粒棘球蚴囊液抗原(EgB)和泡状棘球蚴特异性抗原 (Em2)4种抗原建立一种检测全血标本的棘球蚴病现场快速诊断方法，但是这些方法均属于后期诊断。而本研究为了探索在感染早期能够检测出此病的抗原，在前期研究基础上选择了差异表达蛋白，即副肌球蛋白作为研究对象。大量研究证明，天然及重组副肌球蛋白分子免疫动物均具有明显的抗感染免疫保护力［5-8］。

迄今为止未见国内通过原核表达制备六钩蚴副肌球蛋白相关报道，六钩蚴副肌球蛋白全基因在GenBank中未见收录。但关于副肌球蛋白基因的原核表达已有报道［11-12］。这些报道采用不同的表达载体进行了表达，但均为原核表达方式，以mRNA进行的表达。虽然血吸虫副肌球蛋白株间同源性较高，但种间差异较大，并且日本血吸虫副肌球蛋白存在株内变异现象。由于六钩蚴副肌球蛋白与血吸虫及猪带绦虫的同源性较低，出现交叉反应的可能性也降低［13］。因此本研究对己经克隆的副肌球蛋白基因进行原核表达，将其与表达载体pET30a进行融合表达，避免被细胞蛋白酶降解的可能，大大提高目的蛋白的表达量，降低外源蛋白对表达菌细胞的毒性作用。M26小量表达结果显示蛋白有表达，但是出现杂带，经过分析可能是蛋白在迁移过程中可能会迁移到其它区域或者转印膜上结合有不同质的蛋白，所以染料会有不同的结合色差，造成显色出现杂带，因此，结合以上条件摸索出合适的的一抗或二抗浓度及显色方法可以减少杂带出现。据比较分析，采用可溶性镍柱纯化蛋白效果良好，得到的重组蛋白纯度高，而出现的少量带，可能是因为杂质对镍离子有更高的亲和性，可以优化咪唑浓度，确保蛋白的高纯度。

以纯化的蛋白免疫新西兰大白兔制备了具有较高亲和力的兔抗M26多克隆抗体，经过Western blotting法证明纯化后重组蛋白具有良好的反应原性，ELISA 检测抗体效价达到1∶12800，可满足动物抗体制备的需求。此法简单易行，省去多次洗涤洗脱层析柱的繁琐工作，价格低廉，蛋白产量较大，解决了M26相关研究中样本来源困难的问题，且避免了纯化过程繁杂且易忽略活性片段的难题，为扩大其临床应用价值奠定了基础。

本研究成功实现了重组蛋白的高效表达，纯化的M26重组蛋白具有良好的反应原性和免疫原性［14］。在此基础上，本研究将制备抗细粒棘球六钩蚴副肌球蛋白单克隆抗体，用双抗体夹心ELISA、胶体金等技术，建立可应用于生产实践的快速检测方法，可为包虫病早期检测提供新方案。

［1］Jenkins D J.WHO/OIE manual on Echinococcosis，in humans and animals:a public health problem of global concern［J］.International Journal for Parasitology，2001，31(14):1717-1718.

［2］Pearce E J，James S L，Hieny S，et al.Induction of protective immunity againstSchistosoma mansoniby vaccination with schistosome paramyosin(Sm97)，a nonsurface parasite antigen［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences，1988，85(15):5678-5682.

［3］Kalinna B H，McManus D P.A vaccine against the Asia schistosome，Schistosoma japonicum:anupdate on paramyosin as a target of protective immunity ［J］.Int J Parasitol，1997，27(10):1213-1219.

［4］Schmitz K A，Hale T J，Rajan T V，et al.Localization of paramyosin，myosin，and a heat shock protein 70 in larval and adultBrugia malayi［J］.The Journal of parasitology，1996，82（2）：367.

［5］Gobert G N，Stenzel D J，Jones M K，et al.Schistosoma japonicum:immunolocalization of paramyosin during development［J］.Parasitology，1997，114(01):45-52.

［6］Loukas A，Jones M K，King L T，et al.Receptor for Fc on the surfaces of schistosomes［J］.Infection and Immunity，2001，69(6):3646-3651.

［7］Ferrer E，Moyano E，Benitez L，et al.Cloning and characterization ofTaenia saginataparamyosin cDNA［J］.Parasitology Research，2003，91(1):60-67.

［8］Vázquez-Talavera J，Solis C F，Terrazas L I，et al.Characterization and protective potential of the immune response toTaenia soliumparamyosin in a murine model of cy sticercosis［J］.Infection and immunity，2001，69(9):5412-5416.

［9］Shustov A V，Kotelkin A T，Sorokin A V，et al.TheOpisthorchis felineusparamyosin:cDNA sequence and characteriz ation of its recombinant fragment ［J］.Parasitol Res，2002，88:724-30.

［10］陈新华，温浩，张朝霞，等.全血金标免疫渗滤法快速检测棘球蚴病的现场应用［J］.中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2005，23(2)：90-92.

Chen X H，Wen H，Zhang Z X，et al.Practical application of rapid detection of whole blood immunogold filtration assay in hydatid disease ［J］.Journal of Chinese Parasitology and Parasitic Diseases，2005，23(2)：90-92.

［11］王庆敏，陈蕊雯，郭瀛军，等.猪囊尾蚴副肌球蛋白核酸疫苗的免疫保护性研究［J］.第二军医大学学报，2000，21(6)：504-507.

Wang Q M，Chen R W，Guo Y J，et al.The research of immune protection of paramyosin nucleic acid vaccine inCysticercus cellulosae［J］.Journal of Second Military Medical University，2000，21(6)：504-507.

［12］王新军，张兆松，王勇，等.日本血吸虫副肌球蛋白T细胞表位的预测和鉴定［J］.热带医学杂志，2004，4(6)：653-656.

Wang X J，Zhang Z S，Wang Y，et al.Prediction and identification of T cell epitopes of paramyosin inSchistosoma japonicum［J］.Journal of Tropical Medicine，2004，4(6)：653-656.

［13］Mühlschlegel F，Sygulla L，Frosch P，et al.Paramyosin ofEchinococcus granulosus:cDNA sequence and characterization of a tegumental antigen［J］.Parasitology Research，1993，79(8):660-666.

［14］崔茹鹏，沈文，鲁海富，等.绵羊ISG15基因的克隆表达与纯化［J］.石河子大学学报(自然科学版)，2013，31(1):39-42.

Cui R P，Shen W，Lu H F，et al.Cloning，expression and purification of ISG15 gene in sheep ［J］.Journal of Shihezi University(Natural Science)，2013，31(1):39-42.

Prokaryotic expression, purification and polyclonal antibodyof oncosphere paramyosin in Echinococcus granulosus

Yuan Fangyuan1,Jia Bin1*,Wang Xuhai1,Du Yingchun2,Sun Lirong3,Li Xin1,Li Yaqiang1,Shen Wen1
(1 College of Animal Science and Technology,Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832003,China;2 Aquatic Wildlife Animals and Plants Rescue Center,Beijing 102100,China;3 Center of Quality and Safety of Agricultural and Livestock Products,Tongliao,Inner Mongolia 028000,China)

In order to express and purify the paramyosin of oncosphere inEchinococcus granulosus,and to prepare its polyclonal antibody,the prokaryotic expression vector pET30a-M26 for the paramyosin was constructed,which was transformed intoEscherichia coli（E.coli） BL21 (DE3)and induced expression of the paramyosin.The protein was purified by SDS-PAGE and then immunized with Balb/c mice to prepare polyclonal antibody.Western blotting and ELISA were used to detect paramyosin and antibody,respectively.The results showed that the recombinant protein was about 41 kD,and the purity of the protein was up to 85%and the protein concentration was 0.5 mg/mL.The paramyosin could bind to the prepared polyclonal antibody and ELISA detected the titer of the antibody was 1:12800.The results suggest that the paramyosin can be successfully expressed and purified.This study can lay the foundation for the early diagnosis of hydatid disease.

paramyosin;prokaryotic expression;polyclonal antibody;oncosphere

S852.734；Q78；R383.3

A

10.13880/j.cnki.65-1174/n.2017.03.011

1007-7383(2017)03-0334-05

2016-12-25

国家自然科学基金项目（31260535），石河子大学优秀青年科技培育计划项目（2013ZRKXYQ13），石河子大学优秀青年项目（2012ZRKXYQ01）

袁方园（1993-），女，硕士研究生，研究方向为基础兽医学，e-mail:354708485@qq.com。

*通信作者：贾斌（1965-），男，教授，博士生导师，从事分子遗传与抗病育种研究，e-mail:215273439@qq.com。