徐玉生 理阳 汪鑫 朱海洋 钟斌 李鹏辉 苏一帆

(郑州大学第一附属医院 骨科六病区 河南 郑州 450000)

褪黑素对大鼠急性脊髓损伤后HO-1因子表达的影响

徐玉生 理阳 汪鑫 朱海洋 钟斌 李鹏辉 苏一帆

(郑州大学第一附属医院 骨科六病区 河南 郑州 450000)

目的 研究褪黑素(MT)对大鼠急性脊髓损伤(SCI)后血红素氧合酶(HO-1)表达的影响，探讨MT对SCI的作用机制。方法 选取108只成年SD大鼠，随机分为3组：对照组、损伤组、MT组。对照组仅行椎板切除，暴露T11～T12节段，不损伤脊髓神经。损伤组和MT组用改良的Allen’s法建立T11～T12SCI模型，并分别在SCI后10 min腹腔注射MT溶剂和MT制剂。各组于术后6、12、24 h随机选取12只大鼠处死，取T11～T12节段脊髓标本。其中6个标本液氮保存，以备检测HO-1 mRNA的表达水平，另外6个标本甲醛固定，以备HE染色和免疫荧光切片，观察SCI及修复情况。结果 术后各时间点大鼠脊髓的HO-1 mRNA水平比较：MT组最高，损伤组次之，对照组最低，在12 h和24 h时间点上各组间差异有统计学意义(P<0.05)。HE染色切片观察SCI程度：对照组最轻，MT组次之，损伤组最重。免疫荧光显示：MT组HO-1表达最多，损伤组次之，对照组最少。结论 MT能在大鼠急性SCI后促进HO-1表达，并减轻损伤脊髓的炎性反应。

脊髓损伤；褪黑素；血红素氧合酶-1

脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)是脊柱损伤最严重的并发症。有研究指出，SCI不仅会引起损伤阶段以下肢体的运动或感觉障碍，还能使机体各个系统储备能力降低，超出机体的修复能力，与生理衰老重叠出现过早衰老[1]。SCI后大量的炎性细胞及炎性因子产生、浸润是造成脊髓继发性损伤的主要原因[2]，SCI早期治疗的重点正是控制继发性损伤[3]。实验证实，褪黑素(melatonin，MT)在大鼠SCI后对IL-10、IL-8、TNF-α等多种炎性因子的分泌都有一定的调节作用[4-6]。这为其治疗SCI提供了可能性。但对于SCI后脊髓继发性损伤和修复的机制尚不清楚，并且MT与血红素氧合酶-1(heme oxygense-1，HO-1)之间的关系尚未阐明。本实验通过大鼠SCI后注射MT制剂，观察SCI情况和HO-1表达的变化，探索MT通过HO-1影响SCI的内在联系。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级健康成年雄性大鼠108只，体质量为(230±20)g，采购于河南省实验动物中心，许可证号为SCXK(豫)2010-0002，饲养于通风、温度、湿度适宜的动物房内，不限饮水及进食，每日光照及黑暗各12 h，术前适应性喂养1周。实验过程中的动物处置均符合动物伦理学要求。

1.2 主要试剂及仪器 Transzol试剂、RT试剂盒、PCR试剂盒、Maker均购自北京全式金生物技术有限公司，引物由上海生工生物工程有限公司合成。兔抗鼠HO-1抗体均购自北京博奥森生物技术有限公司，DAB试剂盒、SP9002免疫组化试剂盒购自北京中杉生物技术有限公司。MT、DEPC、EB购自美国SIGMA公司。PCR GeneAmp System(美国Applied Biosystems公司，型号：2700)；低温离心机(美国Sigma公司，型号：3K30)；图像记录分析系统(大连Jim-X Scientific，型号：D140)；电子天平(德国220 g/0.1 mg，型号：BS224S)；恒冷箱切片机(LE ICACM 1900)。

1.3 分组 采用随机数字法将108只大鼠分为3组：对照组(A组)、损伤组(B组)、MT组(C组)。

1.6 HE及免疫荧光 HE染色步骤：切片脱蜡至水；苏木素染色3 min；水洗，1%盐酸酒精分色10 s；水洗，1%伊红染色10 min；水洗，梯度酒精脱水；二甲苯透明，中性树胶封片；显微镜观察，照相。免疫荧光步骤：切片脱蜡至水，PBS洗3次(3×5 min)。柠檬酸抗原修复10 min，自然冷却。PBS浸泡5 min，3次(3×5 min)；3% H2O2封闭内源性过氧化物酶，室温20 min。PBS浸泡5 min，3次(3×5 min)。滴加山羊血清50 μl/片，室温封闭内源性生物素20 min。甩除勿洗，滴加一抗(Nrf2 NQO1/Oxy 1∶100)50 μl/片，4 ℃过夜。PBS浸泡5 min，3次(3×5 min)。滴加荧光素标记二抗(Cy3抗兔1:300)50 μl/片，37 ℃ 2 h。PBS浸泡5 min，3次(3×5 min)；荧光显微镜下采集图像。

1.7 观察指标 各组大鼠术后不同时间点一般情况；HE染色中脊髓组织炎性反应情况；免疫荧光里HO-1蛋白表达情况；脊髓中HO-1 mRNA表达的情况。

1.8 统计学处理 采用SPSS 20.0进行数据分析。应用单因素方差分析和LSD-t检验比较3组大鼠脊髓组织中HO-1 mRNA及蛋白表达水平的差异，检验标准α=0.05。

2 结果

2.1 术后一般状况 共计108只大鼠。麻醉苏醒后，术后B、C两组均出现后肢瘫痪、尿潴留、进食减少等情况，A组大鼠活动情况及进食较术前无明显改变。脊髓标本见B组脊髓组织损伤部位出现溃疡及大量炎症反应；C组脊髓组织炎症反应较轻，未见溃疡面；A组脊髓组织标本炎症反应最轻。

2.2 3组大鼠不同时间点脊髓中HO-1 mRNA表达的比较 各组脊髓中HO-1 mRNA的表达水平在各个时间点上从高到低依次是C组、B组、A组。在SCI后的最早期6 h时间点上，各组数据差异无统计学意义(P>0.05)；在12 h时间点上，各组数据间差异有统计学意义(P<0.05)；在24 h时间点上，各组数据间差异有统计学意义(P<0.01)。见图1、表1。

表1 术后各组各时间点脊髓中HO-1 mRNA表达水平比较(n=6)

注：与C组比较，aP<0.05；与A组比较，bP<0.05。

2.3 3组大鼠不同时间HE染色的比较 A组神经元细胞形态正常，无水肿及坏死，无明显出血点。B组出血灶明显，炎性细胞增生明显，部分神经元水肿、坏死。C组出血灶较B组明显缩小，神经元水肿亦较轻。见图2。2.4 3组大鼠不同时间免疫荧光的比较 HO-1神经细胞胞质中分布较多，呈红色。C组表达最强，B组次之，A组最弱。见图3。

图1 术后各组各时间点RT-PCR结果(n=6)

A组 B组 C组

A组 B组 C组

3 讨论

MT是一种胺类神经内分泌激素，由松果体产生，具有调节时间节律、调节体温中枢等生理作用。近年研究发现，对于SCI，MT不仅具有抗炎、抗氧化、镇痛、调节免疫等功能，还能提高神经营养作用，减少神经细胞凋亡，促进神经营养因子分泌[7-10]。这为SCI的治疗和研究提供新的方法和思路。

血红素氧合酶1，即热休克蛋白32，是一种诱导型的血红素氧合酶，广泛存在于各个组织细胞中，在热休克、重金属、紫外线、缺血缺氧、创伤等多种因素诱导下，HO-1的活性能提高100倍，是目前发现的最容易受诱导的酶。HO-1的催化分解产物是一氧化碳、铁离子、胆红素，它的抗氧化性作用机制与这些产物有关。也有学者指出，HO-1能增加星形细胞、巨噬细胞、胶质细胞内多种酶的活性，从而抑制神经组织的继发性损伤[11]。近来研究表明HO-1对脑损伤有重要的保护作用[12]，但是对于SCI中HO-1的研究尚未透彻，特别是在MT作用下，HO-1在SCI中会有什么样的表达和作用，目前尚未见报道。

从实验结果来看，在各个时间点上，HE染色显示的SCI由轻到重依次是对照组、MT组、损伤组，免疫荧光显示的HO-1表达由少到多分别是对照组、损伤组、MT组。RT-PCR的结果显示，在12 h和24 h时间点上，各组间HO-1 mRNA的表达差异有统计学意义(P<0.05)，并且差异越来越明显(12 h时间点上P<0.05，24 h时间点上P<0.01)。但在6 h时间点上，各组间HO-1 mRNA的表达差异无统计学意义，其原因可能和腹腔注射MT的吸收有关。综上，本实验研究可以证明SCI后MT能促进HO-1的表达，但究竟是通过怎样的信号通路进一步影响炎性因子和细胞营养因子的分泌，还需做进一步的研究。

[1] 王玉明,冯雨桐,李建军,等.脊髓损伤后衰老[J].中国康复理论与实践,2015,21(8):889-893.

[2] 王涛丽,顾兵,李华南,等.急性脊髓损伤后的炎症反应及其抗炎治疗[J].中国药理学通报,2015,31(4):452-457.

[3] 王诗军,李钰婷,李淳德,等.脊髓继发性损伤后细胞因子的表达及其对细胞凋亡的作用[J].中国骨与关节杂志,2016,5(6):432-437.

[4] Li C,Chen X,Qiao S,et al.Melatonin lowers edema after spinal cord injury[J].Neural Regen Res,2014,9(24):2205-2210.

[5] 徐玉生,李星晨,金伟林,等.褪黑素对大鼠急性脊髓损伤后不同时期IL-10表达的影响[J].郑州大学学报(医学版),2013,48(2):193-197.

[6] 徐玉生,张松,金伟林,等.褪黑素对大鼠脊髓损伤后肿瘤坏死因子-α表达的影响[J].郑州大学学报(医学版),2014,47(1):41-44.

[7] Wu Q,Jing Y,Yuan X,et al.Melatonin treatment protects against acute spinal cord injury-induced disruption of blood spinal cord barrier in mice[J].J Mol Neurosci,2014,54(4):714-722.

[8] Wilhelmsen M,Amirian I,Reiter R J,et al.Analgesic effects of melatonin: a review of current evidence from experimental and clinical studies[J].J Pineal Res,2011,51(3):270-277.

[9] Park S,Lee S K,Park K,et al.Beneficial effects of endogenous and exogenous melatonin on neural reconstruction and functional recovery in an animal model of spinal cord injury[J].J Pineal Res,2012,52(1):107-119.

[10]王德桂,马泽民,吕国华,等.褪黑素对大鼠急性脊髓损伤内质网应激蛋白GADD153/CHOP表达的影响[J].中国当代医药,2013,20(16):13-16.

[11]Zhang Z,Li M,Wang Y,et al.Higenamine promotes M2 macrophage activation and reduces Hmgb1 production through HO-1 induction in a murine model of spinal cord injury[J].Int Immunopharmacol,2014,23(2):681-687.

[12]丁克,李桃,王汉东,等.褪黑素对创伤性脑损伤小鼠的抗氧化应激作用及机制研究[J].中华神经医学杂志,2015,14(4):433-439.

Effects of melatonin on the expression of HO-1 factor after acute spinal cord injury

Xu Yusheng, Li Yang, Wang Xin, Zhu Haiyang, Zhong Bin, Li Penghui, Su Yifan

(The Sixth Department of Orthopaedics, the First Affiliated Hospital of ZhengZhou University, ZhengZhou 450000, China)

Objective To study the effects of melatonin (MT) on the expression of heme oxygenase (HO-1) after acute spinal cord injury (SCI) in rats, and explore the effects of MT on spinal cord injury. Methods A total of 108 adult SD rats were selected and randomly divided into three groups: control group, injury group and MT group. Lamina was removed in control group. Consequencely, T11-T12segment was exposed without spinal nerves damage. The T11-T12acute SCI models in injury group and MT group were established by use of the modified Allen’s method. At 10 min after SCI, MT and MT preparations were intraperitoneally injected in injury group and MT group, respectively. In every groups, 12 rats were randomly sacrificed at 6 h, 12 h and 24 h after operation, then T11-T12spinal cord specimens were collected. The 6 specimens were stored in liquid nitrogen for dectecting the expression level of HO-1 mRNA, while the other 6 specimens were fixed with formalin for HE staining and immunofluorescence sections to observe the spinal cord injury and repair. Results At 6 h, 12 h and 24 h, the levels of HO-1 mRNA in MT group were highest, those of which in control group were lowest. Significant differences (P<0.05) in HO-1 mRNA level at 12 h and 24 h were found among control group, injury group and MT group. In terms of SCI degree, control group was lightest, followed by MT control and injury group. In addition, immunofluorescence showed that HO-1 expression in MT group was the most, that of which in control group was the least. Conclusion MT could promote the expression of HO-1 after acute SCI in rats, and reduce the inflammatory response of injured spinal cord.

spinal cord injury; melatonin; heme oxygenase-1

R-332

10.3969/j.issn.1004-437X.2017.09.004

2016-09-23)