张梦燕，孙军利*，赵宝龙，刘晶晶，张帅，李格

（1. 石河子大学农学院，新疆石河子 832000；2. 特色果蔬栽培生理与种质资源利用兵团重点实验室，新疆石河子 832000）

外源ALA对葡萄果实品质及PAL活性的影响

张梦燕1,2，孙军利1,2*，赵宝龙1,2，刘晶晶1，张帅1，李格1,2

（1. 石河子大学农学院，新疆石河子 832000；2. 特色果蔬栽培生理与种质资源利用兵团重点实验室，新疆石河子 832000）

以露地栽培的欧亚种葡萄克瑞森无核和红地球为试验材料，研究了不同浓度的5-氨基乙酰丙酸（ALA）处理对葡萄果实品质及苯丙氨酸裂解酶（PAL）活性的影响。结果表明，不同浓度ALA处理能明显提高葡萄果皮花青素含量及糖酸比幅度，以100 mg/L ALA处理表现最好，且葡萄果实中花青素含量与果肉中可溶性糖含量、可滴定酸含量以及果皮内PAL活性密切相关。果皮中花青素含量与合成相关PAL酶活性、总糖的含量变化趋势呈显著正相关，与总酸含量呈显著负相关，表明ALA处理能有效改善葡萄果实品质及促进葡萄果实着色。

5-氨基乙酰丙酸（ALA）；葡萄；花青苷；品质；PAL活性

果实色泽是作为鲜食消费的重要依据，也是影响葡萄酒品质的重要因素[1-2]。花色苷作为自然界一种重要的植物水溶性色素，是花青素和糖以糖苷键结合而成的一种黄酮类化合物，普遍存在于植物的花、叶、茎、果实和根器官中，通过在细胞的细胞质和内质网膜内合成运输到液泡中，使果实表面呈现出红、紫红到蓝等不同颜色。有研究表明，果皮中花色苷能够提高植物抗光氧化性和抗病性。经常食用花色苷还有利于人体健康，并具有良好的抗氧化、防衰老、抗癌等功效。苯丙氨酸裂解酶（Phenvlalanine Ammonia Lvase，PAL）是一种受多种外界因素影响的诱导酶，通过转录合成能够催化花青苷的生物合成，属于葡萄花色苷生物合成途径中初始反应的关键酶。通过对PAL活性的调节，有学者研究认为PAL能够促进牵牛花等植物中花色苷的形成和积累，从而有效改变矮牵牛的花色[3]。

5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid，ALA）作为自然界动植物以及微生物体内存在的一种生理活性物质，与生命活动有着密切联系。有研究指出，ALA处理能够促进植物叶片光合效率，提高作物产量并改善品质[4]，调节植物的生长发育，被视为一种植物生长调节物质[5]。谢荔[6]对ALA诱导葡萄和苹果果皮花青素积累机理的研究结果表明，ALA处理能够显著提高葡萄果实可溶性糖含量，降低可滴定酸含量，且一定浓度的ALA能显著提高葡萄果皮花青素含量。新疆具有丰富的光热资源，属于葡萄种植的优势产区。但目前生产中有些葡萄品种存在着色困难问题，其中喷施外源ALA改善果品色泽已经在苹果、番茄、红枣等植物上普遍应用，但有关外源ALA是否能够有效促进葡萄果实着色，提高葡萄果实品质及PAL活性的研究较少。本试验以露地栽培欧亚葡萄品种克瑞森无核和红地球为试验材料，研究不同浓度ALA处理对发育成熟期的葡萄果皮着色效果、果实品质及相关酶活性的影响，为ALA在葡萄生产中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

选取石河子大学农学院试验站葡萄园的欧亚葡萄品种克瑞森无核和红地球为试验材料，采用水平连叠式棚架露地栽培，株行距0.5 m×3.5 m，东西行向，独龙干整形，葡萄果实性状表现均匀一致。

1.2 方法

选择架势、长势和负载量均相似的葡萄植株，在葡萄花青素形成的两个高峰期即盛花期后4～8周和14～18周将待用的葡萄果穗用0 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L的ALA溶液喷施葡萄植株及果穗，其中0 mg/L是以清水喷施为对照。在克瑞森无核和红地球两个品种完全成熟期进行采样，每个处理采集3穗果，3次重复，测定葡萄果实的各项生理指标。

1.2.1 果实品质测定

可溶性糖含量测定参照李合生[7]的方法：用蒽酮比色法。可滴定酸含量的测定采用酸碱滴定法[8]。在采集的每个处理果穗中随机选取10粒长势较一致的果粒，去皮后的新鲜果肉用榨汁机打碎混匀，称取3份各1g，用以可溶性糖、可滴定酸含量的测定，重复3次。

1.2.2 果皮PAL活性测定

果皮PAL酶活性测定参考Lister等[9]方法并加以改进，每个处理分别称取果皮1 g，加液氮研磨至粉末状后加入5 mL提取液（0.05 mol/L Na2HPO4(pH7.0)；0.05 mol/L 抗坏血酸；0.018 mol/L巯基乙醇），冰浴匀浆，4 ℃，15 000 r/min离心20 min，上清液即为酶液。取1 mL酶液，加入3 mL反应体系中（2 mL的0.2 mol/L，pH 8.8 的硼酸缓冲溶液；1 mL的0.05 mol/L L-苯丙氨酸），于37 ℃水浴中反应90 min，后加入0.2 mL 6 mol/L HCl终止反应，离心去除沉淀，测定290 nm下吸光值。每分钟光密度变化0.01为1个酶活力单位（U）。酶活性单位表示为U/g FW。

1.2.3 果皮花青素含量测定

果皮花青素含量的测定按照仝月澳等[10]方法加以改进，在采集的每个处理果穗中随机选取10粒均匀一致的果实，剥取果皮用液氮速冻带回实验室于-80 ℃超低温冰箱中贮存待测。每个处理分别称取葡萄果皮1 g剪碎混匀放入刻度试管中，加0.1 mol/L HCl溶液10 mL（盖紧杯口）置32 ℃恒温箱中提取4 h以上，过滤，滤液为花青素提取液，在530 nm波长下测定吸光值。将读取的光密度值乘以10用以代表花青素相对浓度（U/g FW）。

2 结果与分析

2.1 ALA处理对葡萄果肉中可溶性糖、可滴定酸含量及糖酸比的影响

图1、图2显示的是不同浓度ALA处理后葡萄果实完全成熟时可溶性糖与可滴定酸含量的变化。由这两个图可知，在葡萄果实着色期用不同浓度ALA处理可在不同程度上提高果实的可溶性糖含量，同时降低可滴定酸含量。从图1中可看出，经不同浓度ALA处理后，两品种果实中可溶性糖含量明显高于对照处理，以100 mg/L ALA处理表现最好，且显著高于对照，克瑞森无核高达20.23%，红地球达到14.93%。同时，图2显示所有浓度ALA处理两葡萄品种果实中可滴定酸含量明显低于对照，虽差异幅度较糖变化小，但也可看出100 mg/L ALA处理的效果最显著，克瑞森无核葡萄果肉总酸度为0.16%，红地球为0.15%。

结合图1、图2，从图3中可看出，由于可溶性糖含量的上升，可滴定酸下降，3种浓度ALA处理在不同程度上提高了果实的糖酸比，其克瑞森无核葡萄平均增幅达41.83%，红地球葡萄平均增幅达42.54%。

2.2 ALA处理对葡萄果皮中PAL活性变化的影响

图1 不同浓度ALA处理对克瑞森无核及红地球葡萄果实可溶性糖含量的影响

图2 不同浓度ALA处理对克瑞森无核及红地球葡萄果实可滴定酸含量的影响

图3 不同浓度ALA处理对克瑞森无核及红地球葡萄果实糖酸比的影响

从图4中可看出，经不同浓度ALA处理后，两品种葡萄果皮中PAL的活性显著高于对照，同样以100 mg/L ALA处理的促进效应表现最好，克瑞森无核达到134 U/g FW，红地球达到126 U/g FW，50 mg/L和150 mg/L ALA处理之间差异幅度较小。

2.3 ALA处理对葡萄果皮中花青素含量变化的影响

由图5可知，不同浓度ALA处理对葡萄果皮中花青素含量增加的促进效应不同。经不同浓度ALA处理后，两品种葡萄果实完全成熟时花青素含量大幅度提升，显著高于对照处理。其中，100 mg/L ALA处理的促进效应最显著，克瑞森无核葡萄果皮中花青素含量达35.3 U/g FW，红地球达30.4 U/g FW，50 mg/L和150 mg/L ALA处理之间无显著差异。

2.4 果皮花青素与其合成相关PAL酶活性、果肉糖、酸含量的相关性分析

应用 SPSS 16.0对100 mg/L ALA处理的克瑞森无核和红地球两品种果皮花青素与其合成相关PAL活性、果肉可溶性糖、可滴定酸含量进行线性相关分析，结果表明，克瑞森无核和红地球葡萄果皮中花青素的形成与果肉中糖积累量具有显著的正相关关系，同时与果肉中酸含量呈明显负相关。两品种果皮中的花青素的积累量与其合成相关PAL活性均达显著水平。相关系数见表1。

图4 不同浓度ALA处理对克瑞森无核及红地球葡萄果皮PAL活性的影响

图5 不同浓度ALA处理对克瑞森无核及红地球葡萄果皮花青素含量的影响

表1 克瑞森与红地球葡萄果皮花青素与糖、酸及PAL活性的相关系数

3 讨论与结论

果皮色泽是衡量鲜食葡萄果品商品价值的重要指标，同时也是酿酒葡萄果实重要质量指标。大量研究证明，花色苷的含量以及不同花色苷的组成比例是使葡萄浆果与葡萄酒呈现不同颜色的主要因素。花色苷的合成与可溶性糖、可滴定酸含量密切相关[11-12]。花色苷分子由糖和花色素组成，糖不仅是花色苷合成的关键前体物质，更多是通过信号机制作为信号物质促进花色苷的合成。曹雄军等[13]对欧亚种葡萄红宝石无核和红地球果实着色与糖含量关系研究发现，随着果实不断发育，葡萄果皮中花色苷含量与果肉中糖积累量的相关性达到极显著水平，同时与葡萄果肉中酸含量呈极显著负相关，这一结论与本试验结果相符。

PAL基因的表达受到各种类型外源植物激素的影响，王中华等[14]通过在苹果果实着色期喷施ALA对苹果果皮花青素形成的促进效应研究发现，经ALA处理后，果实中可溶性固形物含量显著提高，酸度明显降低，在光照36 h内其果皮中PAL的活性呈现先升高后下降的趋势，且在离体条件下苹果果皮花青素的积累量明显提高。还有学者提出，不仅ALA处理能够促进“富士”苹果果皮中花青素的积累，且ALA生物合成前体谷氨酸也能明显提高花青素的含量[15]。因而，ALA处理对提高果实品质效应具有一定的普遍性。

本研究表明，一定浓度的外源ALA处理能够显著提高葡萄果皮花青素含量及合成相关PAL酶活性，且提高果实可溶性糖含量，可滴定酸含量相应降低，糖酸比大幅度提升，改善了葡萄果实的品质，对葡萄果实着色具有很好促进作用。但从ALA的具体浓度分析来看，ALA对葡萄果实的这种促进作用并不随其浓度的增大而增强，根据ALA浓度的配比存在其处理的最适浓度。本研究发现ALA处理能够大幅度提升葡萄果实的糖酸比，这与前人在ALA促进苹果糖酸含量积累的结果相似。但ALA对促进果实花色苷合成生理机制的研究尚不明确，需进一步试验探讨。

[1] 苏淑钗. 葡萄着色问题研究进展[J]. 葡萄栽培与酿酒, 1994(2): 1-3.

[2] 朱力, POINSANT P, WOLZ S, 等. 结构丰满口感柔顺色泽稳定高档红酒的酿造[J]. 中外葡萄与葡萄酒, 2004(3): 48-53.

[3] JNM M, ARVANDER K, STUITJE A R. Manipulation of floral pigmentation genes in petunia: 'Sense and antisense make sense'[J]. Plant Biology, 1990, 11: 191-202.

[4] 孙永平, 张治平, 徐呈祥, 等. 5-氨基乙酰丙酸处理对低温下西瓜叶片快速叶绿素荧光诱导曲线的影响[J]. 园艺学报, 2009(5): 671-678.

[5] BINDU R C, VIVEKANANDAN M. Hormonal activities of 5-aminolevulinic acid in callus induction and micropropagation. Plant Growth Regulation, 1998, 26(1): 15-18.

[6] 谢荔. ALA诱导葡萄和苹果果皮花青素积累机理的研究[D]. 南京: 南京农业大学, 2012.

[7] 李合生. 植物生理生化实验原理与技术[M]. 北京: 高等教育出版社, 2000: 192-195.

[8] 沈德绪. 果树育种技术[D]. 北京: 农业出版社, 1992.

[9] LISTER C E, LANCASTER J E, WALKER J R L. Developmental changes in enzymes of flavonoid biosynthesis in the skins of red and green apple cultivars[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 1996, 71(3): 313-320.

[10] 仝月澳, 周厚基. 果树营养诊断法[M]. 北京: 农业出版社, 1982: 112-115.

[11] 张祥龙, 金赞敏, 石英, 等. 不同冷浸渍时间对葡萄酒种非花色苷酚的影响[J]. 中外葡萄与葡萄酒, 2013(2): 21-26.

[12] 肖慧琳, 张珍珍, 朱保庆, 等. 川西北干旱河谷地区赤霞珠葡萄果实花色苷的积累[J]. 中外葡萄与葡萄酒, 2012(3): 16-21.

[13] 曹雄军, 石雪晖, 金燕, 等. 红宝石无核和红地球葡萄果实着色与糖、酸含量的关系[J]. 中外葡萄与葡萄酒, 2009(9): 12-15.

[14] 王中华, 汤国辉, 李志强, 等. 5-氨基乙酰丙酸和金雀异黄素促进苹果果皮花青素形成的效应[J]. 园艺学报, 2006, 33(5): 1055-1058.

[15] 汪良驹, 王中华, 李志强, 等. 5-氨基乙酰丙酸促进苹果果实着色的效应[J]. 果树学报, 2004, 21(6): 512-515.

Effects of exogenous ALA on fruit quality and PAL enzyme activity of grapevine

ZHANG Mengyan1,2, SUN Junli1,2*, ZHAO Baolong1,2, LIU Jingjing1, ZHANG Shuai1, LI Ge1,2
(1. College of Agronomy, Shihezi University, 2. Production and Construction Corps Key Laboratory of Special Fruits and Vegetables Cultivation Physiology and Germlasm Resources Utilization, Shihezi 832000)

Crimson Seedless and Red Globe (Vitis vinifera L.cv.) in the open field cultivation as experimental materials, were treated by different concentrations of ALA to investigate the effect of ALA on grape quality and PAL enzyme activity. Results showed that in the process of fruit ripening, sugar, acid and anthocyanidin synthesis related regulatory gene was closely related with the accumulation of anthocyanidin, ALA treatment could obviously increase the contents of sugar and acids in berries, and anthocyanidin content in pericarp, the 100 mg/L ALA treatment was the best. There were signifi cant positive correlation between anthocyanidin content and PAL activity and total sugar content, which was negatively correlated with total acid content. The results indicated that ALA could effectively improve quality and coloration of berries.

5-aminolevulinic acid(ALA); grape; anthocyanidin; quality; PAL enzyme activity

S663.1；Q945.15

A

10.13414/j.cnki.zwpp.2017.03.003

2017-03-05

国家自然科学基金资助项目（31560542）；新疆建设兵团应用基础研究计划项目（2016AG007）

张梦燕，女，四川简阳人，在读硕士研究生。E-mail: 1511449518@qq.com

*通讯作者：孙军利，E-mail: 1530322722@qq.com