李海峰，韩 英，王冰华

(1.新疆农业职业技术学院，新疆昌吉 831100；2.旱区作物逆境生物学国家重点实验室，西北农林科技大学 农学院，陕西杨凌 712100)

二穗短柄草 FRUITFULL1基因表达分析及RNA干扰和过表达载体的构建

李海峰1,2，韩 英2，王冰华2

(1.新疆农业职业技术学院，新疆昌吉 831100；2.旱区作物逆境生物学国家重点实验室，西北农林科技大学 农学院，陕西杨凌 712100)

为了揭示 BdFUL1的生物学功能，利用生物信息学和分子生物学方法，分析二穗短柄草转录因子 FRUITFULL1-2( BdFUL1-2)的结构、序列特征以及与不同植物 AP1/FUL的亲缘关系，构建进化树。利用定量RT-PCR等分子生物学方法，分析非生物逆境和外源激素处理条件下两个转录本 BdFUL1-1和 BdFUL1-2的表达水平。结果表明： BdFUL1属于典型的植物MADS-box基因，与小麦的 WFUL1有很近的亲缘关系；在高温、低温、干旱胁迫以及不同激素ABA、6-BA和SA处理下， BdFUL1-1的表达水平显著升高，暗示 BdFUL1可能通过激素信号传导而参与响应非生物胁迫。同时，构建 BdFUL1-1和 BdFUL1-2的RNA干扰和过表达载体。

短柄草；FRUITFULL；非生物胁迫；RNA干扰；过表达

FUL(FRUITFULL) 基因属于植物 AP1/FUL的FUL亚家族，是被子植物所特有的[1]。在模式植物拟南芥，粮食作物水稻(Oryzasativa)、玉米(Zeamays)、小麦(Triticumaestivum)，果蔬类作物番茄(Solanumlycopersicum) 基因组中都有FUL同源基因存在。在木本植物桃树(Prunuspersica)、苹果(MalusdomesticaBorkh) 和葡萄(Vitisvinifera) 等基因组中也发现有FUL同源基因[2]。

拟南芥中,FRUITFULL(FUL)基因和APETALA1(AP1)以及CAL一起调控花分生组织的发育。同时，在花发育早期和花发育晚期，FUL基因分别调控花序分生组织和心皮及角果的发育[3]。

在普通小麦中有3个FUL-LIKE同源基因： WFUL1(VRN1)、 WFUL2和 WFUL3。 WFUL1(VRN1) 是应答低温诱导、参与春化作用的特征基因[4]； WFUL2和B类以及E类基因相互作用，可能具有A类基因的功能。进一步研究表明 WFUL1可能通过上调 WFUL3基因，促进植物开花[5]。

水稻基因组中有3个FUL-LIKE亚家族成员，分别为 OsMADS14、 OsMADS15、 OsMADS18。 OsMADS15突变体dep内稃皱缩，严重失去内稃的主要结构，而只发育形成两侧的边缘结构，同时外稃和颖片伸长[6]，这说明 OsMADS15/DEP在内稃的发育上起着主要作用。另外， OsMADS14、 OsMADS15、 OsMADS18和 OsMADS34冗余的调控营养阶段向生殖阶段的过渡[7]。

二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)是一种广泛生长在温带的一年生草类植物。由于体型矮小，易于种植，生命周期短，基因组比较小等特点，2001年Draper等率先建议把短柄草作为模式植物开展研究[8]。二倍体基因型 Bd-21基因组测序已经完成，预测到25 532个编码蛋白质的基因[9]。

短柄草基因组中有3个FUL-LIKE基因，分别为 BdFUL1、 BdFUL2a和 BdFUL2b基因[10]。其中 FUL1和水稻中的 OsMADS14同源。在前期研究中，窦艳华等[11]克隆二穗短柄草 BdFUL1基因的cDNA序列，分析该基因的可变剪接和表达模式。在此基础上，本研究分析高温、低温、NaCl、PEG、ABA、6-BA、SA胁迫处理条件下两个转录本的表达，并构建该基因的RNA干扰和过表达载体，为进一步解析该基因的生物学功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

二穗短柄草 Bd-21，剥去外稃和內稃的种子，放置于人工气候箱的培养皿中，26 ℃、光照16 h催芽萌发；1周后移栽到装有营养基质的小盆中，4 ℃春化室春化2周，然后移入西北农林科技大学旱区作物逆境生物学国家重点实验室人工气候室。生长条件为26 ℃光照16 h；22 ℃暗培养8 h。抽穗后3 d取小穗提取总RNA。胁迫处理选用水培2周的幼苗。培养条件同样为26 ℃光照16 h；22 ℃暗培养8 h。

1.2 方 法

1.2.1 序列分析 运用NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)的Blast搜索同源的蛋白质序列，并进行同源序列比对。运用DNAMAN软件进行序列多重比对。运用MEGA 5.1软件构建系统进化树。

1.2.2 引物的设计 引物设计运用Primer Premier 5 软件，定量引物BDF1DLPF、BdF1DLPR1、BdF1DLPR2,RNAi载体引物BDF1IFPF1、BDF1IFPR1、BDF1IFPF2、BDF1IFPR2和过表达载体引物BdF1OF、BdF1OR1、BdF1OR2的设计参照 BdFUL1基因组序列以及成熟mRNA BdFUL1-1和 BdFUL1-2的不同拼接位点(表1)。

表1 引物序列

1.2.3 胁迫处理条件下表达水平的分析 选用水培2周的幼苗进行各种非生物胁迫处理。冷胁迫处理为4 ℃，热胁迫处理为45 ℃，干旱胁迫处理用0.2 g/mL PEG-6000，盐胁迫处理用 200 mmol/L NaCl，激素处理分别为100 mol/L ABA、20 μmol/L 6-BA和1 mmol/L SA。取材时间点为处理2 h，冷胁迫和热胁迫处理取幼苗叶片，其他胁迫处理取幼苗的根，提取RNA，26 ℃未胁迫处理的幼苗作为对照。

RNA的提取运用Trizol(上海生工生物工程有限责任公司)方法，按照说明书操作。用反转录试剂盒(PrimeScript RT reagent Kit,Fermentas,Canada)合成第1链cDNA，按照说明书操作。qRT-PCR方法参照文献[11]，具体如下：用CFX96 Real-time PCR detection Systems,按照SYBR Premix ExTaq(Tli RNaseH Plus)试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司)操作说明进行荧光定量RT-PCR。PCR反应体系15 μL,含0.5 μL cDNA(5.0 ng/μL),7.5 μL SYBR Premix ExTaq(2×,上海生工生物有限工程公司),各0.75 μL上、下游引物(10 pmol/μL),ddH2O 5.5 μL。扩增条件为:95 ℃预变性30 s;95 ℃变性5 s,55 ℃退火30 s,40个循环; 65 ℃延伸10 s，共61个循环。设3次生物学重复和3次试验重复。按窦艳华等[11]描述的方法分析数据。

1.2.4 RNAi载体的构建 中间载体选用改造后在多克隆位点连接上GUS内含子的pBSK载体，最终载体选用上海交通大学杨洪全教授实验室改造的双元载体pHB。 PCR产物克隆到pMD18-T载体后，先用NotⅠ和BamHⅠ双酶切，连接到同样双酶切的pBSK上。PCR产物再用HindⅢ和EcoRⅠ双酶切，连接到同样双酶切的上步重组pBSK质粒上。第二步重组的质粒和pHB分别用HindⅢ和SacⅠ双酶切，连接。阳性克隆分别用菌落PCR或双酶切鉴定并经测序确认。

1.2.5 过表达载体的构建 载体同样选用双元载体pHB，PCR产物克隆到pMD18-T载体后，用HindⅢ和XbaⅠ双酶切,连接到同样双酶切的pHB载体上。阳性克隆分别用菌落PCR和双酶切鉴定并经测序确认。

2 结果与分析

2.1 序列分析

根据窦艳华等[11]克隆得到的 BdFUL1基因的序列，NCBI的Blastp分析结果表明 BdFUL1-2属于MADS-box转录因子家族，具有MADS-box和K-box两个保守的功能结构域(如图1)。将 BdFUL1基因序列在NCBI数据库中进行在线分析和BLAST比对发现， BdFUL1-2与小麦、水稻、玉米FUL-LIKE转录因子有较高的同源性，其中与小麦 WFUL1同源性最高，达到87%。

图1 BdFUL1-2的保守结构域

采用DNAMAN软件对短柄草、小麦、水稻、玉米、拟南芥、番茄的FUL-like转录因子进行多重序列比对。结果显示(图2)，仅氨基末端的MADS-box区域比较保守，其余区域则存在明显差异(图2)。结构的相似和差异显示，FUL蛋白的功能既具有保守性又发生了分化。使用MEGA 5.1软件中的邻接法构建系统进化树(图3)。结果表明单子叶和双子叶植物的FUL-like转录因子存在差异，单子叶植物的FUL-like转录因子蛋白存在3个分支。其中 BdFUL1与小麦WFUL1、水稻 OsMADS14、玉米ZMM4和ZMM15从属于FUL1分支，可能具有相似功能。

2.2 非生物胁迫处理下 BdFUL1-1和 BdFUL1-2的表达水平

运用qRT-PCR的方法，分析 BdFUL1-1、 BdFUL1-2的在各种胁迫处理下的表达。结果显示(图4)，低温和高温胁迫条件下， BdFUL1的两个可变拼接的表达量均有所上升，特别是 BdFUL1-1的表达水平显著升高，明显高于对照和同样条件处理下 BdFUL1-2的表达水平；ABA、6-BA、SA处理条件下， BdFUL1的两个可变拼接的表达量也均有所上升，同时 BdFUL1-1表达水平明显高于 BdFUL1-2；NaCl处理条件下, BdFUL1的两个可变拼接的表达水平则无明显变化。

2.3 RNAi载体的构建

为了分别沉默 BdFUL1-1和 BdFUL1-2的表达，分别设计2对引物，扩增不同的cDNA片段，特异的沉默 BdFUL1-1和 BdFUL1-2。BDF1IFPF1和BDF1IFPR2组合扩增的片段则同时沉默 BdFUL1-1和 BdFUL1-2。图5-A、5-B、5-C分别显示RT-PCR扩增得到的的3个cDNA片段，与预期大小一致。图5-D显示3个片段克隆到pMD-18T载体后双酶切验证的结果。图6-A～6-C为3个不同的片段反向和正向连接到中间载体后，分别用HindⅢ和SacⅠ双酶切鉴定的结果，条带与预期大小一致。图6-D是连接到pHB上最终的3个重组载体 BdFUL1-RNAi1、 BdFUL1-RNAi2和 BdFUL1-RNAi3分别用HindⅢ和SacⅠ双酶切的鉴定结果，酶切片段分别和图5-A～5-C泳道的片段一致。在双酶切鉴定的基础上，测序结果显示序列完全正确，表明成功构建了3个RNAi载体。

图2 FUL蛋白序列比对

AP1/FUL蛋白质在NCBI数据库上的登录号 Accession numbers for AP1/FUL proteins in NCBI：AtAP1：NP_177074；At FUL / At AGL8：NP_568929；At CAL / At AGL10：NP_564243；AtAGL79：NP_189645；SlFUL1：AAM33098；SlFUL2：NP_001294867； OsMADS14：NP_001051300； OsMADS15： NP_001058720 ； OsMADS18：NP_001060225； OsMADS20： AAO92341； BdFUL1/ BdMADS33：AIG21841；BdFUL2/ BdMADS10：ADQ92357； BdFUL3/ BdMADS3：AIG21814 BdMADS31：AIG21840；ZAP1：AAB00081；ZMM3：AAG43200；ZMM4：NP_001105151；ZMM15：ABW84393；WFUL1/VRN1：AAP33790； WFUL2：CAM59049； WFUL3：ABG21009

CK-L：对照幼苗的叶片 Leaves of control seedlings；C-L：低温处理幼苗的叶片 Leaves of low temperature-treated seedlings；H-L：高温处理幼苗的叶片 Leaves of high temperature-treated seedlings；CK-R：对照幼苗的根 Roots of control seedlings；PEG-R、NaCl-R、ABA-R、6-BA-R和SA-R：分别表示PEG、NaCl、ABA、6-BA和SA处理幼苗的根 PEGR,NaClR,ABAR,6-BAR and SAR:represent leaves of treated seedlings by PEG,NaCl,ABA,6-BA and SA,respectively

A:引物BDF1IFPF1和BDF1IFPR1扩增的RT-PCR产物 RT-PCR product amplified with primer BDF1IFPF1 and BDF1IFPR1; B:引物BDF1IFPF2和BDF1IFPR2扩增的RT-PCR产物 RT-PCR product amplified with primer BDF1IFPF2 and BDF1IFPR2; C:引物BDF1IFPF1和BDF1IFPR2扩增的RT-PCR产物 RT-PCR product amplified with primer BDF1IFPF1 and BDF1IFPR2; D:3个重组pMD-18T载体NotⅠ和BamHⅠ双酶切的结果 NotⅠ and BamHⅠ digestion of three recombinant pMD-18T vectors

A-C：PCR产物反向和正向序列连接到中间载体后HindⅢ和SacⅠ 双酶切的验证结果 Verification with double digestion of bridge vectors by HindⅢ and SacⅠ after RT-PCR products were cloned in forward and reverse direction respectively；D：最终载体HindⅢ和SacⅠ 双酶切的验证结果 Double digestion of final recombinant vector by HindⅢ and SacⅠ

2.4 过表达载体的构建

在构建RNA干扰载体的基础上，同时还构建该基因两个可变拼接的过表达载体，分别命名为pHB- BdFUL1-1和pHB- BdFUL1-2。

图7-A显示RT-PCR扩增得到的FUL1-1和 FUL1-2的序列，片段大小与预期的633 bp和732 bp一致。图7-B显示2个目的片段已经分别连接到pHB上,切出与图7-A同样大小的条带。经过测序验证，表明已成功构建 BdFUL1-1和 BdFUL1-2的过表达载体。

A:编码cDNA Encoding cDNA；1. BdFUL1-1;2. BdFUL1-2。B：最终重组载体HindⅢ和XbaⅠ 双酶切结果 Final recombinant vectors digested by HindⅢ and XbaⅠ;3.pHB- BdFUL1-1；4.pHB- BdFUL1-2;M.DNA Marker

3 讨 论

3.1FUL-like基因具有广泛的生物学功能

拟南芥FUL基因调控花序、花分生组织的发育，还影响心皮、角果和叶片的发育[3]。小麦 FUL1响应春化作用[4]。水稻中FUL基因调控內稃的发育，更重要的是通过调控茎端分生组织向花序分生组织的过渡，调控植物的开花时间[6-7]。

为克隆调控开花时间的基因，用来进行分子育种，选取和水稻 MADS14同源的 BdFUL1进行研究。表达分析结果表明该基因特别是可变拼接 BdFUL1-1的表达受高温、低温和干旱等非生物胁迫的强烈诱导，暗示该基因可能还参与植物的逆境响应。

3.2 非生物胁迫诱导 BdFUL1可变剪接的产生

可变剪接，即1个mRNA前体经过不同的剪切和拼接产生2个或者多个成熟mRNA的过程。可变剪接是造成生物体内转录组和蛋白质组多样性和复杂性的重要机制[12]。二穗短柄草的基因组较小，重复序列较少，可变剪接普遍发生[13]。研究发现，某些基因在特异的细胞或者组织中，或者在特定发育阶段，或者在外界环境改变、受到生物或者非生物胁迫时，发生可变拼接的机率会更高[14]。研究发现，在盐分、温度、干旱等环境胁迫下，小麦Wdreb2、水稻OsDREB2B和玉米ZmDREB2A等DREB/CBF类转录因子发生可变剪接，从而帮助植物适应上述逆境带来的组织脱水。这表明，可变拼接是禾本科植物响应逆境胁迫的一种机制，具有重要作用[15-17]。低温、高温、干旱胁迫以及激素处理条件下， BdFUL1基因的两个可变剪接 BdFUL1-1和 BdFUL1-2的表达量发生变化，特别是 BdFUL1-1的表达水平显著升高，暗示 BdFUL1基因功能可能与应答环境胁迫有关。但是，非生物胁迫通过什么机制诱导 BdFUL1-1水平的升高，还有待深入研究。

3.3 RNA干扰基因功能常用的方法

在研究双子叶模式植物拟南芥和单子叶模式植物水稻基因功能时，研究者一般采用正向或者反向遗传学策略，去分离鉴定目的基因的突变体，根据突变体的表型去分析基因的生物学功能。

短柄草是新型的禾本科模式植物，短柄草基因功能的研究刚刚开始，突变体库比较少。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是基于双链RNA能够降解序列特异的目标基因mRNA的技术[18-19]。该技术问世后在动物植物方面得到广泛应用。运用RNA干扰一次可以沉默一个基因的表达，也可以同时沉默几个序列同源基因的表达。Cui等[20]一次就沉默水稻4个E类基因的表达，Kobayashi等[21]同时沉默3个水稻A类基因的表达。在克隆 BdFUL1的cDNA序列，分析其可变拼接和表达模式的基础上，为了研究解析其生物学功能，构建3个 BdFUL1的RNAi载体，以期通过转基因的方法去研究 BdFUL1-1和 BdFUL1-2功能上的差别。

致谢：感谢西北农林科技大学陈明训博士对论文修改所提的建议。

Reference：

[1] LITT A,IRISH V F.Duplication and diversification in the APETALA1/FRUITFULL floral homeotic gene lineage:implications for the evolution of floral development[J].Genetics,2003,165(2):821-833.

[2] 褚婷婷,谢 华,徐 勇,等.植物 MADS-box 基因 FRUITFULL(FUL) 研究进展[J].中国生物工程杂志,2010,30(9):98-104.

CHU T T ,XIE H,XU Y,etal.Research advances of plant MADS-box gene FRUITFULL( FUL) [J].ChinaBiotechnology,2010,30(9):98-104(in Chinese with English abstract).

[3] FERRANDIZ C,GU Q,MARTIENSSEN R,etal.Redundant regulation of meristem identity and plant architecture by FRUITFULL,APETALA1 and CAULIFLOWER[J].Development,2000,127(4):725-734.

[4] PRESTON J C,KELLOGG E A,Conservation and divergence of APETALA1/FRUITFULL-like gene function in grasses:evidence from gene expression analyses[J].PlantJ,2007,52(1):69-81.

[5] KINJO H,SHITSUKAWA N,TAKUMI S,etal.Diversification of three APETALA1/FRUITFULL-like genes in wheat[J].MolGenetGenomics,2012,287(4):283-294.

[6] WANG K,TANG D,HONG L,etal.DEP and AFO regulate reproductive habit in rice[J].PLoSGenet,2010,6(1):e1000818.

[7] KOBAYASHI K,YASUNO N,SATO Y,etal.Inflorescence meristem identity in rice is specified by overlapping functions of three AP1/FUL-like MADS-box genes and PAP2,a SEPALLATA MADS-box gene[J].ThePlantCell,2012,24(5):1848-1859.

[8] DRAPER J,MUR L A,JENKINS G,etal.Brachypodiumdistachyon.A new model system for functional genomics in grasses[J].PlantPhysiology,2001,127(4):1539-1555.

[9] VOGEL J P,GARVEN D F,MOCKLER T C,etal.Genome sequencing and analysis of the model grassBrachypodiumdistachyon[J].Nature,2010,463(7282):763-768.

[10] JILL C P,ELIZABETH A K.Reconstructing the evolutionary history of paralogous APETALA1/FRUITFULL-like genes in grasses(Poaceae) [J].Genetics,2006,174(1):421-437.

[11] 窦艳华,韩萌萌,孙其信,等.二穗短柄草 MADS-BOX 基因 AGL6 和 FUL1 的可变拼接和表达模式分析[J].农业生物技术学报,2015,23(4):459-468.

DOU Y H,HAN M M,SUN Q X,etal.Alternative splicing and expression pattern analyses of two MADS-BOX genes inBrachypodiumdistachyon[J].JournalofAgriculturalBiotechnology,2015,23(4):459-468(in Chinese with English abstract).

[12] 周冬虎,姜 颖,贺福初.组学时代的可变剪接研究进展[J].中国科学:生命科学,2015,12(45):1177-1184.

ZHOU D H,JIANG Y,HE F CH.Alternative splicing in lifeomics era[J].ScientiaSinicaVitae,2015,12(45):1177-1184(in Chinese with English abstract).

[13] WALTERS B,LUM G,SABLOK G,etal.Genome-wide landscape of alternative splicing events inBrachypodiumdistachyon[J].DNAResearch,2013,20(2):163-171.

[14] STAIGER D,BROWN J.Alternative splicing at the intersection of biological timing,development,and stress responses[J].PlantCell,2013,25(10):3640-3656.

[15] EGAWA C,KOBAYASHI F,ISHIBASHI M,etal.Differential regulation of transcript accumulation and alternative splicing of a DREB2 homolog under abiotic stress conditions in common wheat[J].Genes&GeneticSystems,2006,81(2):77-91.

[16] QIN F,KAKIMOTO M,SAKUMA Y,etal.Regulation and functional analysis of ZmDREB2A in response to drought and heat stresses inZeamaysL[J].ThePlantJournal,2007,50(1):54-69.

[17] MATSUKURA S,MIZOI J,YOSHIDA T,etal.Comprehensive analysis of rice DREB2-type genes that encode transcription factors involved in the expression of abiotic stress-responsive genes[J].MolecularGeneticsandGenomics,2010,283(2):185-196.

[18] BAULCOMBE D.RNA silencing in plants[J].Nature,2004,431(7006):356-363.

[19] MARX J.Interfering with gene expression[J].Science,2000,288(5470):1370.

[20] CUI R,HAN J,ZHAO S,etal.Functional conservation and diversification of class E floral homeotic genes in rice(Oryzasativa) [J].ThePlantJournal,2010,61(5):767-781.

[21] KOBAYASHI K,MAEKAWA M,MIYAO A,etal.PANICLE PHYTOMER2(PAP2),encoding a SEPALLATA subfamily MADS-box protein,positively controls spikelet meristem identity in rice[J].PlantandCellPhysiology,2010,51(1):47-57.

(责任编辑：郭柏寿 Responsible editor:GUO Baishou)

Expression Analysis and Construction of RNA Interference and Over-expression Vectors ofBrachypodiumdistachyonFRUITFULL1

LI Haifeng1,2,HAN Ying2and WANG Binghua2

(1.College of Xinjiang Agricultural Vocational & Technical,Changji Xinjiang 831100，China; 2.State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas,College of Agronomy,Northwest A&F University,Yangling Shaanxi 712100,China)

To explore the biological function of transcription factor FRUITFULL1( BdFUL1) fromBrachypodiumdistachyon,we analyzed the structure and the sequence feature of BdFUL1-2,and then constructed phylogenetic tree with methods of bioinformatics and molecular biology to show its genetic relationship with AP1/FUL family genes from other plant species. Moreover,the expression level of BdFUL1-1 and BdFUL1-2 which were under different abiotic stresses and treated with different exogenous plant hormones was analyzed by quantitative RT-PCR. The results indicated that BdFUL1 as a typical MADS-box transcription factor had a close genetic relationship with WFUL1 from wheat. Besides, BdFUL1-1 was significantly induced by different abiotic stresses including heat,coldness,and drought,and different plant hormones such as ABA,6-BA,and SA,it suggested that BdFUL1 should be involved in the response to abiotic stresses through the hormone signaling pathway. In addition,RNA interference and overexpression constructing BdFUL1-1 and BdFUL1-2 were successfully created.

Brachypodiumdistachyon; FRUITFULL; Abiotic stress; RNA interference; Over-expression

LI Haifeng,male,Ph D,professor.Research area:plant molecular biology.E-mail:lhf@nwsuaf.edu.cn

日期：2017-05-22

2016-05-05

2016-06-10

国家自然科学基金(31571657);中央高校基本科研业务费(2014ZZ009);新疆农业职业技术学院科研项目(XJNZYKJ201501和XJNZYKJ201512)。

李海峰，男，博士，教授，研究方向为作物分子生物学。E-mail:lhfxn@sina.cn

Q94; Q7

A

1004-1389(2017)05-0767-08

网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170522.0857.032.html

Received 2016-05-05 Returned 2016-06-10

Foundation item The National Natural Science Foundation of China(No.31571657);the Fundamental Research Funds for the Central Universities(No.2014ZZ009)；Funds of Xinjiang Agricultural Vocational and Technical College(No.XJNZYKJ201501，No.XJNZYKJ201512).