朱永刚，王 磊，张景艳，王旭荣，崔东安，张 凯，张 康，王学智，杨志强，李建喜

(中国农业科学院 兰州畜牧与兽药研究所，甘肃省中兽药工程技术研究中心，兰州 730050)

主成分分析法与聚类分析法在胎衣不下奶牛血液生化研究中的应用

朱永刚，王 磊，张景艳，王旭荣，崔东安，张 凯，张 康，王学智，杨志强，李建喜

(中国农业科学院 兰州畜牧与兽药研究所，甘肃省中兽药工程技术研究中心，兰州 730050)

通过分析胎衣不下奶牛血液生化指标的变化特征，为奶牛胎衣不下早期诊断方法的建立提供依据。产犊后立即无菌采集47头奶牛血液，其中25头为胎衣正常排出奶牛，22头为胎衣不下奶牛；血液生化分析仪检测血清生化指标，主成分分析法与聚类分析法分析检测结果。结果表明，16项血清生化指标被聚类成3个主成分，主成分聚类分析的结果与临床采集样品的分类结果一致；与胎衣正常排出奶牛相比，胎衣不下奶牛的血清中乳酸脱氢酶、谷草转氨酶、谷氨酰胺转移酶、肌酸激酶水平显著升高。表明，主成分分析和聚类分析可以有效地区别胎衣不下奶牛血清和胎衣正常排出奶牛血清，因此可以通过此方法对奶牛产后胎衣不下的发生进行提前诊断；还表明奶牛胎衣不下的发生不仅与蛋白质代谢、离子代谢和肌肉代谢紊乱有关，而且肝脏和肾脏的机能损伤也可能导致胎衣不下。

奶牛胎衣不下；主成分分析；生化指标

奶牛胎衣不下(Retained fetal membranes，RFM)是奶牛产后最需要重视的疾病之一[1-2]，正常奶牛胎衣排出是在胎儿产出后12 h内[3]。奶牛胎衣不下是指奶牛产犊后12 h内胎衣未排出或者部分排出[4]。中国奶牛胎衣不下的发病率多为4%～11%[5-6]，炎热地区可高达50%[7-9]。因胎衣不下常引起子宫内膜炎、子宫蓄脓和子宫脱出等产科疾病，影响奶牛再孕及产奶。如果对患病奶牛治疗不当或者治疗不及时往往会导致奶牛患乳房炎，腐败的胎衣和细菌感染经子宫吸收后还可引起败血症，从而危及奶牛生命，给奶牛业造成巨大的经济损失[10-11]。胎衣不下的病因复杂，影响因素较多，主要有激素、免疫、围产期营养状况、产后子宫收缩、双胎、难产等[10,12-13]。虽然近年来对该病的发病原因进行大量研究，但是其发病的关键机制至今尚不清楚，直接影响临床的防治效果。因此，全面了解奶牛胎衣不下的发生机制，采取有效的检测方法，对胎衣不下的早期诊断和治疗是非常重要的。血清中的一些酶类等代谢物质由相应的器官和组织产生，这些酶类等代谢物质的改变能够反应机体因其病理变化产生相应的变化，通过对患病和健康奶牛的血清生化指标检测并分析主要代谢物的改变，能够判断机体的器官或组织是否发生改变，从而达到辅助临床诊断的目的。以往对胎衣不下的研究主要通过对血液中钙、磷、葡萄糖等成分的分析，无法客观、全面的从血液生化指标方面揭示奶牛胎衣不下的发病原因[14-16]。主成分分析和聚类分析是应用多元统计分析的原理，对多个变量进行研究的数学方法。主成分分析通过对众多的观测变量进行分析，找出较少的综合变量类替代原来的变量信息，从而更好地去反映事物的本质。聚类分析则是依据变量的性质和特征的相似程度将彼此相近的样本聚为一类，而差异较大的则分在不同的类[17-18]。本文旨在利用主成分分析和聚类分析法对胎衣不下奶牛的血清生化指标进行研究，寻找胎衣不下奶牛主要血清代谢物质的变化，然后以这些血清物质为指标，对产后胎衣不下牛和胎衣正常排出牛进行分类，为奶牛胎衣不下的发病机制以及预防和治疗研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

全自动生化分析仪(BS-420，深圳迈瑞公司)；肌酐(CREA)测定试剂盒、乳酸脱氢酶(LDH)测定试剂盒、谷丙转氨酶(ALT)测定试剂盒、碱性磷酸酶(ALP)测定试剂盒、谷草转氨酶(AST)测定试剂盒、谷氨酰胺转肽酶(γ-GT)测定试剂盒、总蛋白(TP) 测定试剂盒、白蛋白(ALB) 测定试剂盒、总胆红素(T-Bil)测定试剂盒、直接胆红素(D-Bil) 测定试剂盒、总胆固醇(TC) 测定试剂盒、甘油三酯(TG) 测定试剂盒、钙(Ca)测定试剂盒、镁(Mg) 测定试剂盒、磷(P) 测定试剂盒、肌酸激酶(CK)测定试剂盒均购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司；高速低温离心机为Sigma公司产品。

1.2 试验动物选择

2016年2月-3月，于甘肃荷斯坦奶牛繁育示范中心按照年龄、胎次、产后体况评分和分娩日期相近为基本原则，选取47头围产期荷斯坦奶牛。

1.3 样品采集与分组

47头荷斯坦奶牛产犊后立刻通过颈静脉无菌采血，每头10 mL，放入一次性采血管内，室温静置待血液完全凝固后放入离心机内，4 ℃、4 000 r/min离心10 min，分离血清，-20 ℃保存，备用。产后经兽医诊断，47头奶牛分为胎衣不下组(血清22份)和胎衣正常排出组(血清25份)。诊断标准为：奶牛产犊后12 h内胎衣未排出或未完全排出视为胎衣不下。

1.4 奶牛主要临床指标的观察

观察奶牛胎衣不下的发生率和子宫内膜炎的发病率，记录胎衣排出的时间、恶露排尽时间、首次发情时间、受孕时间等。

1.5 血清生化指标的检测

参照测定试剂盒的使用方法，对血清中CREA、LDH、ALT、ALP、AST、γ-GT、TP、 ALB、 T-Bil、D-Bil、TC、TG、Ca、Mg、P、CK进行检测，并计算球蛋白值(球蛋白=TP-ALB)。

1.6 数据分析

所有数据均采用SAS9.2统计软件进行分析。采用主成分分析和聚类分析法进行处理分析。通过SAS9.2 统计软件对各项指标进行差异性检测，其中数据均为“平均值±标准差”。

2 结果与分析

2.1 奶牛主要临床指标的观察

由表1可知，胎衣正常排出组25头奶牛分娩后恶露排出时间和颜色均正常，有24头在产后90 d内受孕，受孕率96%；胎衣不下组22头奶牛有6头在产后90 d内受孕，有10头发生明显子宫炎症。胎衣不下组的总受孕率为27%，与胎衣正常排出组相比，差异极显著(P<0.01)。

表1 奶牛产后主要临床指标

注：*表示差异显著(P<0.05)；**表示差异极显著(P<0.01)。下同。

Note: * indicates significant difference (P<0.05);* * indicates extremely significant difference (P<0.01).The same as below.

2.2 血清生化指标检测

2.2.1 血清生化指标检测 由表2可知，与胎衣正常排出奶牛相比，胎衣不下奶牛血清中，LDH、AST、γ-GT和CK显著升高(P<0.05)，其余各项指标均无显著差异(P>0.05)。数据均为“平均数±标准差”。

2.2.2 基于主成分对血清生化指标检测分析 由表3可知，对16项血清生化分析指标进行主成分分析，根据特征值大于1的原则，选取3个主成分，其特征值分别为10.013、1.443、1.301，基本上反映原来的变量信息。主成分变量Y1=0.229×ALB+0.298×Ga+0.297×TP+0.266×P+……；主成分变量Y1代表血清蛋白和离子水平的代谢指征，单独说明变量的62.5%，Y2=0.556×CK+0.473×D-Bil -0.339 9×TC +……；主成分变量Y2代表肌肉和肝胆代谢指征，单独说明变量的9.02%，Y3=0.553×ALP-0.395×D-Bil +……；主成分变量Y3代表肝肾代谢指征，单独说明变量的8.13%。

根据上述的3个主成分对上述采集血清的生化分析指标进行聚类分析，采用类平均的聚类方法。图1为聚类分析的水平树状图，其中OB1～OB22为胎衣不下奶牛血清，OB23～OB47为胎衣正常排出奶牛血清，从水平树状图中可以将所有观测样本分为3大类：OB1～OB5、OB7～OB22为一大类；OB23、OB25～OB47为一大类。OB6、OB24为单独一类。

将OB6、OB24数据除去后，用主成分分析法对检测的16项血清生化指标进行聚类分析，所得结果基本与采样分类结果一致。其中OB6、OB24独立成为1类。

表2 血清生化指标统计

表3 奶牛血清生化指标主成分矩阵特征值、贡献率、累计贡献率

图1 聚类分析水平树状图

3 讨 论

3.1 主成分的聚类分析

主成分分析是医学、生物学、育种学、经济学上常用的一种多元统计分析方法。它是根据性状间的相关性，找出能反应主要信息的少数几个相互独立的综合性状，主要应用于样品分类及排序、简化数据结构，寻找综合因子等方面[19-21]。聚类分析则是一种分类学与多元分析相结合的多元统计分析方法，它是将分类的对象全部置于一个多维空间中，按照它们空间关系的疏密程度进行分类。聚类分析的目的是依据样品间的相似性或者指标间的相关性对样品或指标进行归类[22-24]。影响胎衣不下的血清生化指标有很多，在正常分析中，难以做到对所有的指标进行选择[14-16]。在此种情况下，可以考虑在多个指标中选择有代表性的1个或几个性状直接进行选择，或者制定少数几个性状的综合指数进行选择。因此本试验将主成分分析和聚类分析法引入奶牛胎衣不下血清生化指标的分析是一个尝试，应用此方法对产后奶牛血液成分变化的原因进行研究，通过将血清样本的16项生化指标经过主成分分析转化为3项能够代表原来样本的综合性生物学指标，分别是血清蛋白和离子水平的代谢指征、肌肉和肝胆代谢指征和肝肾代谢指征。这与一些报道[14,25-31]中胎衣不下与血清中离子水平失衡、子宫平滑肌收缩乏力和围产期代谢水平紊乱具有相关性的结果一致。本试验采用主成分分析法和聚类分析法来分析所检测的血清生化指标是否能够有效反映产后奶牛胎衣的排出状态，结果表明与临床采样分类方法一致，基本能够区别胎衣不下奶牛和胎衣正常排出奶牛的血清，故该方法能够作为产后提前诊断胎衣不下的方法。但是在聚类分析过程中，没有将观测样本OB6、OB24的数据分离开，而是单独聚为一类，原因可能是这两头试验牛同时感染其他疾病，使血清中一些指标有较大的改变，从而影响最终的分类。如OB6中乳酸脱氢酶为1 288 U/L，明显高于同组平均值630 U/L；OB24中谷草转氨酶为188 μ/L，明显高于同组平均值63 μ/L。

3.2 胎衣不下对奶牛血清生化指标的影响

机体体内代谢是一个稳态过程，检测血液中一些指标的变化能够更好地了解疾病的发生转归过程，从而达到预防、治疗疾病的目的。乳酸脱氢酶是糖代谢中催化丙酮酸向酵解方向的终产物乳酸转化的酶，动物在分娩应激时，首先保证中枢神经系统、心肌和子宫肌等重要器官的供氧，其他组织在缺氧的情况下采取无氧酵解方式供能，胎衣不下奶牛由于胎衣未排出，子宫肌继续收缩，无氧酵解状态延长，因此胎衣不下奶牛血液中乳酸脱氢酶含量较胎衣正常排出奶牛高。Peter等[32]研究发现，胎衣不下奶牛血清中乳酸脱氢酶活性较正常牛高，这与本试验结果一致，表明胎衣不下可能与血清中乳酸脱氢酶升高有关。谷草转氨酶和谷氨酰胺转肽酶是反应肝脏潜在损伤的重要酶类[33]。韩银华[34]进行奶牛肝功能与生产性能、繁殖性能的相关性研究发现，与健康牛相比，肝功能异常奶牛的胎衣不下发病率较高。本试验结果基本与之相似，胎衣不下奶牛谷草转氨酶与谷氨酰氨转肽酶活性较胎衣正常排出奶牛的显著提高，表明胎衣不下可能与谷草转氨酶和谷氨酰氨转肽酶活性异常升高有关。

肌酸激酶(CK)又称为肌酸磷酸激酶(CPK)，其主要功能是催化肌酸与ATP之间高能磷酸键的可逆性转移，是肌肉收缩能量的来源，正常情况下血液中的肌酸含量较少，一旦出现肌肉收缩强度提高，血液中肌酸含量将大幅度升高[35-36]。本试验中，胎衣不下奶牛肌酸激酶活性较胎衣正常排出奶牛的活性低，说明胎衣不下的发生与肌肉收缩强度较低有关。

4 结 论

本研究结果表明，主成分分析法和聚类分析法对血液生化指标表现出很好的降维和聚类效果，并且通过主成分分析方法和聚类分析方法对所选取的奶牛血液生化指标进行分析，其结果能够很好的反映奶牛的胎衣排出情况。另外，血清生化指标分析的结果表明，胎衣不下的发生不仅仅与蛋白质代谢、离子代谢和肌肉代谢紊乱有关，还可能与肝肾功能损伤和离子代谢紊乱有密切联系。

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(责任编辑：顾玉兰 Responsible editor:GU Yulan)

Application of Analysis of Principal Component and Cluster in Blood Biochemical of Cows with Retained Fetal Membranes

ZHU Yonggang,WANG Lei,ZHANG Jingyan, WANG Xurong,CUI Dongan, ZHANG Kai, ZHANG Kang, WANG Xuezhi, YANG Zhiqiang and LI Jianxi

(Lanzhou Institute of Husbandry and Pharmaceutical Science of Chinese Academy of Agricultural Sciences,Engineering &Technology Research Center of Traditional Chinese Veterinary Medicine of Gansu Province,Lanzhou 730050,China)

This study aims to study the characteristics changes in blood biochemical indexes in cows with retained fetal membranes, so as to establish diagnostic methods for cows with retained fetal membranes. Forty-seven serums were collected after calving, of which twenty-five were cows without retained fetal membranes and twenty-two were cows with retained fetal membranes. The serums were detected by blood biochemical analyzer, then used principal component analysis to analyze the results. The result shows that:sixteen serum biochemical index were clustered into three principal components, according to the three main ingredients of cluster analysis of principal component , classification results consistent with clinical samples, the method could be used to do early diagnosis of cows with retained fetal membranes.The levels of lactate dehydrogenase, aspertate aminotransferase, glutamine transferase, creatine kinase were significantly difference in the cows with retained fetal membranes and cows without retained fetal membranes . Based on principal component and cluster analysis,the results of the serum biochemical indicators showed that this method could diagnose cows with retained fetal membranes and cows without retained fetal membranes efficiently. So this method could be uses to early diagnose cows with retained fetal after calving . This result also showed that retained fetal membranes was not only associated with disorders of protein metabolism, ion metabolism and muscle metabolism, but also associated with the damage of liver and kidney.

Retained fetal membranes; Principal component analysis; Biochemical indicators

ZHU Yonggang, male,master student.Research area:prevention and control of animal disease.E-mail:40829330@qq.com

LI jianxi,male,research fellow,doctoral supervisor. Research area: Chinese veterinarian medicine and immunology. E-mail: lzjianxil@163.com

日期：2017-05-22

2016-07-26

2016-09-30

公益性行业(农业)科研专项(201303040)；国家奶牛产业技术体系(CARS-37-06)。

朱永刚，男，硕士研究生，研究方向为动物疫病防控相关研究。E-mail:40829330@qq.com

李建喜，男，研究员，博士生导师，研究方向为中兽医药学与免疫学。 E-mail:lzjianxil@163.com

S852.65

A

1004-1389(2017)05-0685-08

网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170522.0857.012.html

Received 2016-07-26 Returned 2016-09-30

Foundation item Special Fund for Agro-scientific Research in the Public Interest (No.201303040); Dairy Industry Technology and Systems Projects(No. CARS-37-06).