刘婷婷，邢青斌，程家丽，沈 葹，卓 勤

(中国疾病预防控制中心营养与健康所，北京 100050)

非转基因和转基因小麦中氨基酸含量的分析及比较

刘婷婷，邢青斌，程家丽，沈 葹，卓 勤

(中国疾病预防控制中心营养与健康所，北京 100050)

目的：对小麦中氨基酸分析的水解方法进行研究，比较非转基因和转基因小麦中氨基酸的含量。方法：样品用含0.1%巯基乙酸的盐酸溶液水解提取，样液经定容、过滤、浓缩、复溶、过膜后，用氨基酸分析仪测定，外标法定量。结果：应用含巯基乙酸的盐酸水解液对小麦样品进行水解的同时有效防止了含硫氨基酸(蛋氨酸和半胱氨酸)的氧化，相对氧化水解方法节省前处理时间，方法的回收率为93%～99%，相对标准偏差小于2.4%。非转基因和转基因小麦样品的17种氨基酸分析，氨基酸含量不存在显著性差异。结论：该方法准确快速、重现性好，适用于小麦中氨基酸含量分析的检测要求。

氨基酸；转基因小麦；非转基因小麦；氨基酸分析仪

小麦是世界上最重要的农作物之一，是世界上栽培面积最大、总产量最多的粮食作物，也是人类最重要的植物蛋白质来源，而组成蛋白质的氨基酸在小麦的营养品质方面起着决定作用。自1992年人类获得第一株转基因小麦以来，抗虫、抗病等转基因小麦的研究取得一定进展[1-2]。

由于多数氨基酸无紫外吸收和荧光发射特性，需通过衍生化后进行检测。国内外许多学者对其进行研究，开发出柱前衍生的高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法、阴离子交换色谱-积分脉冲安培检测法等[3-5]。经典的氨基酸分析方法是应用氨基酸分析仪，采用柱后用茚三酮衍生的阳离子交换色谱法，该方法准确可靠、重现性好。

本实验使用氨基酸分析仪，对其前处理过程进行优化，建立了更加准确快速的小麦中氨基酸含量分析的检测方法。通过对不同实验基地的非转基因和转基因小麦样品的测定，分析其所含的氨基酸成分和含量，为进一步科学认识转基因和非转基因小麦中的氨基酸提供一定的依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小麦试验样品：原料样品用四分法缩减，粉碎备用。样品编号1～4，其中1、2为非转基因小麦(济麦22)，3、4为转基因小麦(16联鉴10)，1、3来自山东实验基地，2、4来自山西实验基地。济麦22是16联鉴10的非转基因对照种，转基因小麦(16联鉴10)进行了抗逆相关的DREB(脱水应答元件结合蛋白)类转录因子基因GmDREB3的转录，该基因具有持久耐盐性。

17种氨基酸标样：美国Sigma公司；盐酸(优级纯)：北京试剂公司；巯基乙酸：美国Sigma公司；氨基酸分析仪配套的流动相(茚三酮溶液和缓冲液)：日本和光公司。

1.2 仪器和设备

L-8900型氨基酸分析仪：日本日立公司；电热恒温干燥箱：上海森信；浓缩仪：TAITEC公司；自动凯氏定氮仪：FOSS公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白质含量的测定 称取约0.20 g样品，加入4.5 mL浓硫酸和催化剂片(K2SO41.5g；Se0.0075g)，过夜，同时做样品空白管。次日，置凯氏消化器消化6h，待消化完全后用自动定氮分析仪测定氮含量[6]。

1.3.2 氨基酸样品预处理 称取样品约0.15g于水解管中，在水解管内加6mol/L盐酸(含0.5%巯基乙酸)15mL，再将水解管放入冷冻剂中，冷冻3～5min，再接到真空泵的抽气管上，抽真空，然后充入高纯氮气；在充氮气状态下封口，将已封口的水解管放在110±1℃的恒温干燥箱内，水解22h后，取出冷却。

打开水解管，将水解液全部转移到50mL容量瓶内，用去离子水定容，多次冲洗水解管。将水解液过滤后，吸取滤液1mL于10mL管中，用真空浓缩器在50℃左右抽干，残留物用1～2mL水溶解，最后蒸干，用2.0mL 0.02moL/L稀盐酸溶解，过滤后供仪器测定。

1.3.3 色谱条件 色谱柱：水解氨基酸专用色谱柱；检测波长：570nm，其中脯氨酸检测波长为440nm；分析柱温度：57℃；反应柱温度：135℃；进样体积：20μL；洗脱溶液流速：0.4mL/min；柱后衍生试剂流速：0.35mL/min。

2 结果与分析

2.1 蛋白质含量

通过凯氏定氮法测得的小麦样品蛋白质含量见表1。

表1 样品中蛋白质含量(n=6)

2.2 方法的精密度

准确吸取标准储备溶液，用0.02moL/mL稀盐酸稀释配制混合标准溶液(0.10μmoL/mL)。从图1～2中可以看出，峰窄而尖，基线平稳，分离效果好。在实际样品中，目标峰也与样品中的其他杂质峰分离良好。取同一批样品6份，按上述前处理过程做精密度试验，结果显示，相对标准偏差(RSD)小于2.4%，表明此检测方法有较好的重复性。

2.3 水解方法对氨基酸检测结果的影响

在酸水解过程中，植物性蛋白质样品中的含硫氨基酸(蛋氨酸和半胱氨酸)会部分氧化，导致检测值比实际含量值偏低，因此含硫氨基酸回收率的提高是保证水解氨基酸检测结果准确的关键。传统的处理方法是首先利用氧化水解法，将含硫氨基酸用过甲酸试剂氧化成对酸稳定性物质，再进行水解处理，此氧化方法需冰浴反应16～18h，前处理分析时间较长，不适宜高通量样品的处理[7]。本实验采用含0.1%巯基乙酸的盐酸水解液，由于巯基乙酸既具有羟酸的反应特征，又具有巯基的反应特征，直接对植物性蛋白样品进行水解的同时，可有效防止了含硫氨基酸(蛋氨酸和半胱氨酸)的氧化，减少了氨基酸前处理过程中的氧化损失。

用3种不同的的前处理水解方法对1号小麦样品进行添加回收实验的结果见表2。可以看出加入巯基乙酸的盐酸水解法与氧化水解法对样品中含硫氨基酸的水解效果均较好，所得到的含硫氨基酸加标回收率高于常规盐酸水解的处理方法。加入巯基乙酸的盐酸水解液分析步骤相对简单，节省前处理时间，重现性好，回收率高。

图1 17种氨基酸标准溶液色谱图

图2 小麦样品中17种氨基酸测定色谱图

组别含硫氨基酸添加值(g/100g)测定均值(g/100g)相对标准偏差(%)回收率(%)含0.1%巯基乙酸的6moL/mL盐酸水解组半胱氨酸00.2652.230.500.7292.0192.91.001.2121.3294.7蛋氨酸00.2082.120.500.6911.8990.61.001.1981.1599.06moL/mL盐酸水解组半胱氨酸00.2022.360.500.6552.1590.61.001.1871.5192.2蛋氨酸00.1472.020.500.5511.8680.81.000.9681.3282.1甲酸试剂氧化后盐酸水解组半胱氨酸00.2562.330.500.7292.0992.81.001.2251.5895.9蛋氨酸00.2122.390.500.6842.1195.21.001.1871.3697.9

2.4 样品检测结果

通过氨基酸分析仪对来自山东和山西转基因农作物实验基地的非转基因和转基因小麦样品中的17种氨基酸进行分析(表3)。对实验所得数据进行检验异方差假设分析，得到双尾P值，P>0.05时表示差异不显著。从表3中的P值可以看出转基因和非转基因小麦中的17种氨基酸P值均大于0.05，所以转基因和非转基因小麦中氨基酸含量不存在显著性差异。小麦的氨基酸含量总和基本等于其蛋白质的含量，回收率>99%。间接证明了本方法检测小麦中氨基酸含量的的准确性。

表3 样品中氨基酸含量比较(n=6)

3 结论与讨论

本实验通过对小麦中氨基酸分析的水解方法进行研究，在盐酸水解液中加入巯基乙酸，防止了含硫氨基酸(半胱氨酸和蛋氨酸)在传统酸水解方法中的氧化损失，分析步骤相对简单，相对氧化水解方法节省前处理时间，重现性好，回收率高。小麦中氨基酸含量总和基本等于其蛋白质的含量，证明了本方法检测小麦中氨基酸含量的准确性。

本文通过氨基酸分析仪对转基因农作物实验基地的非转基因和转基因小麦样品中的17种氨基酸进行分析，对实验所得数据进行分析，转基因和非转基因小麦中氨基酸含量不存在显著性差异。◇

[1]周岩，薛晓峰，魏琦超，等.小麦转基因技术研究进展[J]. 生物技术通报，2012(5)：53-59.

[2]喻修道，徐兆师，陈明.小麦转基因技术研究及其应用[J]. 中国农业科学，2010，43(8)：1539-1553.

[3]高燕红，朝阳，鲁琳.应用柱前衍生法和柱后衍生法测定氨基酸方法的比较[J]. 中国医学检验杂志，2004，5(2)：133-135.

[4]Langrock T，Czihal P，Horrmann R.Amino acid analysis by hydrophilic interaction chromatography coupled on-line to electrospray ionization mass spectrometry[J]. Amino Acids，2006，30(2)：291-297.

[5]于泓，丁永胜，牟世芬.阴离子交换色谱-积分脉冲安培检测法分离测定氨基酸注射液中的氨基酸和葡糖糖[J]. 色谱，2002，20(5)：398-401.

[6]中华人民共和国卫生部 GB 5009.5-2010 食品中蛋白质的测定[S].北京：中国标准出版社，2010.

[7]李玉玲，李卫华，杨秀清.反相高效液相色谱法检测奶粉中含硫氨基酸[J]. 食品科学，2012，33(8)：167-170.

(责任编辑 李婷婷)

Determination and Comparison of Amino Acids in Non-transgenic Wheat and Transgenic Wheat

LIU Ting-ting，XING Qing-bin，CHENG Jia-li，SHEN Shi，ZHUO Qin

(Institute of Nutrition and Health，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Beijing 100050，China)

amino acid；transgenic wheat；non-transgenic wheat;amino acid analyzer

转基因生物新品种培育国家科技重大专项课题“转基因生物的食用和饲用安全评价技术”(项目编号：2014ZX08011-005、2016ZX08011-005)。

刘婷婷(1985— )，女，硕士，助理研究员，研究方向：食物成分分析。

卓勤(1969— )女，博士，研究员，研究方向：营养与食品卫生。