许楚旋，江 北，张 琪，吴巧玉，蒋冬花

（浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江 金华 321004）

紫色红曲霉M-35菌株产淀粉酶发酵条件和培养基配方的优化

许楚旋，江 北，张 琪，吴巧玉，蒋冬花

（浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江 金华 321004）

以实验室前期从红曲米中筛选的高产淀粉酶紫色红曲霉（Monascus purpureus）M-35菌株为研究对象，将单因素试验结果与响应面分析法相结合，对M-35菌株的发酵条件和培养基配方进行优化。摇瓶发酵单因素试验优化了培养温度、初始pH值、碳源种类和含量、氮源种类和含量、金属离子种类和含量等。采用Minitab 17软件的P-B试验设计法，筛选对淀粉酶活有显著影响的因素为：淀粉含量、蛋白胨含量和NaCl含量。根据P-B试验结果，运用响应面法分析，确定M-35菌株产淀粉酶优化的培养基配方为：淀粉含量7.5%，蛋白胨含量4.0 %，NaCl含量0.5 %；在此条件下，淀粉酶活最高为276.14 U/mL，较优化前提高约1.57倍。利用优化的培养基配方和条件进行5L发酵罐发酵试验，结果表明，M-35菌株发酵80 ～116 h，淀粉酶活可稳定在296 U/mL左右。

淀粉酶；紫色红曲霉；响应面；发酵条件；培养及配方；优化

红曲霉（Monascus）是腐生真菌，广泛存在于泥土、植物组织、河川表面沉淀物以及粮食谷物等物质中；其生长适宜温度在32～35℃之间，适宜pH值在3.5～6.0之间，尤其在酸性环境中生长旺盛[1]。红曲霉是我国重要的食用、药用真菌，是传统中药红曲的基原菌，也是制作传统饮品红曲酒的主要菌种，被广泛应用于食品发酵、食品着色、中药配伍等领域[2-3]。红曲霉生长过程中能产生多种酶，如淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、脂肪酶等，这些酶在制药和调味品加工过程中起着非常重要的作用[4-5]。

淀粉酶广泛存在于微生物和动植物体内，可以将淀粉水解形成糊精、低聚糖和葡萄糖等低分子物质，改善制品的风味；另外，由其作用生成的葡萄糖又可以进一步异构化成果糖，得到商品化的高果糖浆。目前，研究较多的产淀粉酶微生物有芽孢杆菌[6-7]、根霉、曲酶[8-9]等，关于红曲霉产淀粉酶的研究报道相对较少[10-11]。因此，该研究以实验室前期从自然发酵红曲米中筛选获得的高产淀粉酶优质菌株为材料，通过培养基配方和培养条件的优化，提高其淀粉酶产量和酶活，为进一步发掘和利用红曲霉资源奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株来源 紫色红曲霉（Monascus purpureus）M-35菌株（以下称M-35菌株），为实验室前期从红曲米中筛选到的高产淀粉酶优良菌株。

1.1.2 培养基 （1）PDA培养基：马铃薯20%、葡萄糖2.0%、琼脂1.8%、pH值5.5；用于M-35菌株的常规培养和活化。（2）种子培养液：可溶性淀粉5.0%、蛋白胨2.0%、NaCl 0.5%、pH 值5.5；用于M-35菌株的种子培养。（3）发酵基础培养液：可溶性淀粉（碳源）5.0%、蛋白胨（氮源）2.0%、NaCl（金属离子）0.5%、pH值5.5；用作M-35菌株培养基配方和发酵条件优化的基础培养基。（4）5 L发酵罐发酵培养液：可溶性淀粉7.5%，蛋白胨4.0%，NaCl 0.5%、pH值6.0；用于M-35菌株的5 L发酵罐培养。

1.1.3 3, 5-二硝基水杨酸试剂（DNS）试剂及其配制标准DNS试剂的配制参照《食品成分分析手册》的方法，用于还原糖含量的测定。

1.2 试验方法

1.2.1 M-35菌株的培养和粗酶液制备 将保存的M-35菌株接种到PDA培养基上，28℃恒温活化培养5 d；用8 mm的打孔器取6个菌饼接入50 mL种子培养液（200 mL三角瓶）中，置于30 ℃、180 r/min的摇床培养4 d，用作种子液；将种子液按5%的体积接种到发酵培养液中，30 ℃、180 r/min的摇床培养6 d。培养液在4℃、8 000 r/min离心10 min，取上清液即为淀粉粗酶液。

1.2.2 粗酶液淀粉酶活的检测 用DNS法测定酶反应后生成的还原糖量（以葡萄糖为标准），以此来检测粗酶液淀粉酶活性，具体方法如下：在20 mL试管中加入2 mL 5 %（W/V）可溶性淀粉悬液和2 mL 0.1 mol/L的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液（pH值5.0），将混合液在40℃的水浴环境中提前预热10 min；加入1 mL淀粉酶粗酶液，40℃水浴反应1 h，水浴过程中不断摇动；加入2 mL DNS试剂终止反应，将混合液置于沸水浴中煮沸5 min，待溶液冷却后，加入蒸馏水定容至20 mL；在520 nm波长下，用分光光度计测量溶液的吸光值，参照葡萄糖标准曲线计算生成的还原糖含量，计算红曲霉M-35菌株产淀粉酶的酶活。淀粉酶酶活的定义：在以上反应条件下，1 min释放1 μg葡萄糖的酶量定义为一个活力单位。

1.2.3 培养条件的单因素优化 （1）培养温度：将保存的M-35菌株接种到PDA培养基上，28 ℃活化培养6 d；用8 mm的打孔器取6个菌饼接入50 mL种子培养液（200 mL三角瓶）中，30 ℃、180 r/min摇床培养3 d后；将种子液按5%的体积接种到发酵基础培养液中，分别置于24、26、28、30、32和34 ℃温度下，180 r/min摇床培养6 d；培养液在8 000 r/min离心10 min，取上清液即为粗酶液。每个处理设3次重复，根据红曲霉菌株淀粉酶活的检测方法，参照葡萄糖标准曲线和淀粉酶酶活的定义分析不同培养温度对淀粉酶酶活的影响。（2）初始pH值：调节发酵培养基初始pH值分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0。每个处理设3次重复，接种、培养、酶活检测等方法同培养温度。

1.2.4 培养基配方的单因素优化 以发酵基础培养液为基础，替换碳源、氮源、金属离子等，探讨培养基配方对M-35菌株产淀粉酶的影响。（1）碳源种类：木糖、淀粉、甘油、蔗糖、麦芽糖；（2）碳源（淀粉）含量：2.5%、5.0%、7.5%、10.0%、12.5%；（3）氮源种类：氮源：氯化铵、硝酸钾、蛋白胨、尿素、硝酸铵；（4）氮源（蛋白胨）含量：2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%；（5）金属离子种类：镁离子、铜离子、钙离子、锰离子、钠离子、钾离子；（6）金属离子（NaCl）含量：0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7% 。每个处理设3次重复，接种、培养、酶活检测等方法同培养温度。

这是我人生中第一次替父亲抽号。那是2011年的夏天，巨浪牧场2号楼竣工。农场场部机关会议室人声鼎沸、座无虚席。父亲早已激动得不知迈哪条腿走路，还是母亲比较淡定：“二楼好，更上一层楼嘛！”

1.2.5 培养基配方的Box-Behnken试验设计 在单因素优化试验的基础上设计自变量为淀粉含量（%）、蛋白胨含量（%）和NaCl含量（%），分别用A、B、C代表，每个自变量又有低、中、高水平编码值分别为-1、0、+1，发酵液中淀粉酶活为响应值。试验因素水平见表1。

表1 Box-Behnken试验设计的因素水平

1.2.6 培养基配方的响应面优化 采用Stat-Ease Design-Expert 8.1中的Box-Bennken试验设计法优化培养基配方。

1.2.7 M-35在发酵过程中的生长曲线及产淀粉酶规律 利用优化的培养基配方和条件进行5 L发酵罐发酵试验，测定M-35菌株在5 L发酵罐中的生长曲线及产淀粉酶规律。

（1）生长曲线的测定。一是M-35菌株的培养：将保存的M-35菌株接种到PDA培养基上，28 ℃活化培养6 d；用8 mm的打孔器取6个菌饼接入50 mL种子培养液（200 mL三角瓶）中，置于30 ℃、180 r/ min下摇床培养3 d，用作一级种子液。将一级种子液按5%的体积接种到发酵基础培养液，30 ℃、180 r/ min摇床培养2 d，用作二级种子液；将二级种子液按20%的体积接种到5 L发酵罐发酵培养液发酵。二是菌丝干重的测定：50 mL空离心管放于在85℃的烘箱中烘干，称取空离心管质量为m；每管吸取10 mL发酵液，在4 ℃，10 000 r/min离心10 min，弃上清；无菌蒸馏水洗3次，10 000 r/min离心10 min，弃上清，放入85℃烘箱中烘至恒重，称取质量为M；菌丝干重=M-m。每隔4 h取10 mL发酵液（每个时间点设3个平行试验组，求平均值；取样后补加相同体积发酵培养基）测定菌丝干重。以发酵时间为横坐标，菌丝干重为纵坐标绘制生长曲线。

（2）产淀粉酶曲线的测定。每隔4 h取10 mL发酵液，检测淀粉酶活大小，酶活检测设3个平行试验组，求平均值。以发酵时间为横坐标，淀粉酶活为纵坐标绘制淀粉酶产生曲线。

2 结果与分析

2.1 M-35菌株培养条件的优化

（1）培养温度：结果见图1A，当培养温度为30℃时，产淀粉酶活最高，为176 U/mL。因此，M-35菌株产淀粉酶后续培养温度用30℃。

2.2 M-35菌株培养基配方的优化

（1）碳源种类：结果见图2A，碳源为淀粉时，M-35菌株产淀粉酶活最高。

（2）碳源（淀粉）含量：结果见图2B，当淀粉含量为7.5%时，M-35菌株产淀粉酶活达最大。

（3）氮源种类：对M-35菌株产淀粉酶活性的影响如图3A所示，氮源为蛋白胨时，M-35菌株产淀粉酶活最大。

（4）氮源（蛋白胨）含量：蛋白胨含量对M-35菌株产淀粉酶活性的影响如图3B所示，当蛋白胨含量为4.0%时，M-35菌株产淀粉酶活最大。

（5）金属离子种类：对M-35菌株产淀粉酶活性的影响如图4A所示，钠离子对M-35菌株提高淀粉酶活具有较好的促进作用。

（6）NaCl含量：对M-35菌株产淀粉酶活性的影响如图4B所示，当NaCl的含量为0.5%时，M-35菌株产淀粉酶活最大。

2.3 响应面优化M-35菌株的培养基配方

图1 培养温度和培养基初始pH值对M-35菌株产淀粉酶活性的影响

图2 碳源种类和碳源含量对M-35菌株产淀粉酶活性的影响

图3 氮源种类和氮源含量对M-35菌株产淀粉酶活性的影响

图4 金属离子种类和NaCl含量对M-35菌株产淀粉酶活性的影响

2.3.1 模型方程的建立与显著性检验 利用SAS8.1软件对Box-Behnken 试验设计结果（表2）进行二次线性回归拟合，得到数学模型：Y=275.38-7.17A-4.39B+0.47C+4.82AB+4.27AC-1.20BC-13.60A2-14.88B2-7.76C2。由表3可知，该模型F值极显著（P＜0.01），R2=0.990 4，说明该模型能解释99%响应值的变化；复相关系数，进一步说明该模型拟合度较好；失拟合不显著（P＞0.05），说明二次线性回归方程高度显著，能较好的预测响应值Y。从响应值F值可知，各因素对淀粉酶活性影响因素显著性顺序为：淀粉含量＞蛋白胨含量＞NaCl含量。

2.3.2 培养基配方的响应面优化分析图 响应图和等高线图由SAS8.1软件分析得出，可以直观反映出各个因素与响应值的交互作用。

（1）蛋白胨含量与淀粉含量的响应面：由图5可知，当蛋白胨含量在（3.0，4.0）区间，淀粉含量在（5.0，7.5）区间内，淀粉酶活性随着两者含量的升高而升高，呈现正相关。当蛋白胨含量在（4.0，5.0）区间，淀粉含量在（7.5，10）区间内，淀粉酶活性随着两者含量的升高而降低，呈现负相关。

（2）NaCl含量与淀粉含量的响应面：由图6可知，当NaCl含量在（0.4，0.5）区间，淀粉含量在（5.0，7.5）区间内，淀粉酶活性随着两者含量的升高而升高，呈现正相关。当NaCl含量在（0.5，0.6）区间，淀粉含量在（7.5，10.0）区间内，淀粉酶活性随着两者含量的升高而降低，呈现负相关。

（3）蛋白胨含量与NaCl含量的响应面：由图7可以看出，当NaCl含量在（0.4，0.5）区间，蛋白胨含量在（3.0，4.0）区间内，淀粉酶活性随着两者含量的升高而升高，呈现正相关。当NaCl含量在（0.5，0.6）区间，蛋白胨含量在（4.0，5.0）区间内，淀粉酶活性随着两者含量的升高而降低，呈现负相关。

2.3.3 模型结论 为确定最佳点，再对数学回归模型求一阶偏导，得到优化的培养基配方为：淀粉含量7.5%，蛋白胨含量4.0%，NaCl含量0.5%，淀粉酶活性达到276.14 U/mL。经3次试验验证，在此条件下发酵液的淀粉酶活性达到275.92 mg/L。这表明在该试验条件下建立的数学模型准确可靠，试验实际值和预测值拟合度较好。

表2 Box-Behnken 试验设计结果

表3 回归方程统计分析结果

2.4 M-35菌株在发酵过程中的生长曲线及产淀粉酶产生规律

2.4.1 生长曲线 由图8可知，0～8 h为M-35菌株的延滞期，延滞期很短；8～60 h为对数期，当发酵培养60 h时，M-35菌株的生物量最大为 43.16 g/L；60～96h是M-35菌株生长的稳定期，96 h以后开始进入衰亡期。

图5 淀粉酶活关于蛋白胨含量与淀粉含量的响应面（左）与等高线（右）

图6 淀粉酶活关于NaCl含量与淀粉含量的响应面（左）与等高线(右)

图7 淀粉酶活关于NaCl含量与蛋白胨含量的响应面（左）与等高线（右）

2.4.2 产淀粉酶曲线 由图8可知，M-35菌株产淀粉酶活性的高低随着菌株的生长不断变化，0～80 h产淀粉酶活性不断增加；80～116 h，M-35菌株产淀粉酶活性基本稳定在296 U/mL左右，120 h以后，M-35菌株代谢速率降低，产生的淀粉酶活性也随之降低。

3 结论与讨论

以实验室筛选的产淀粉酶红曲霉M-35菌株为研究对象，探讨了培养温度、培养基pH值等条件以及培养基中不同碳氮源、金属离子和NaCl含量，对M-35菌株产淀粉酶的影响。结果表明，适宜培养温度为30℃、培养基pH值为6.0，适宜碳氮源分别为淀粉和蛋白胨。当淀粉作为碳源时，产淀粉酶活性达到最大，高于其他碳源，表明淀粉酶可能是一种诱导酶，淀粉能够诱导淀粉酶的产生，也有利于红曲霉的生长。当蛋白胨作为氮源时，产淀粉酶活性达到最大，高于其他氮源。Box-Behnken 试验设计结果表明，对M-35菌株产淀粉酶活影响较大的3个因素分别是淀粉含量、蛋白胨含量和NaCl含量，通过响应面分析和验证，得出适宜液态产淀粉酶培养基配方为：淀粉7.5 %、蛋白胨4.0 %、NaCl 0.50 %。利用优化的发酵培养基配方，可降低淀粉酶的生产成本。

图8 M-35菌株在发酵过程中的生长曲线及产淀粉酶曲线

有研究表明，不同类型的淀粉酶在优化培养条件下，可以提高淀粉酶的活性。卢争辉等[12]研究表明，产碱性淀粉酶菌株的最适反应pH 值为9.5；夏媛媛[13]等将产淀粉酶的菌株置于最优条件下培养，其淀粉酶活性可达312 U/mL；孙海彦[14]等采用响应面法优化产淀粉酶菌株的培养条件，最终使淀粉酶活性增加了7.5倍；李鹏等[15]从海洋中筛选产淀粉酶的菌株，通过产酶培养条件的优化，产酶量增加了19.1%。该试验单因素试验结果与响应面分析法相结合优化淀粉酶活性达276.14 U/mL，较优化前提高约1.57倍。

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（责任编辑：成 平）

Fermentation Conditions and Medium Optimizing of Monascus purpureus Strain M-35 Producing High-yielding Amylase

XU Chu-xuan，JIANG Bei，ZHANG Qi，WU Qiao-yu，JIANG Dong-hua
（College of Chemistry and Life Science, Zhejiang Normal University, Jinhua 321004, PRC）

Single factor experiment and response surface methodology was combined to optimize the submerged culture conditions and medium for the production of amylase enzyme using Monascus purpureus strain M-35 as material, which had high yield of amylase and purified from the natural fermentation of red yeast rice. The culture temperature, initial pH, kind and content of carbon source, nitrogen source and content, variety of metal ions, and content were optimize by shake flask fermentation single factor experiment. Using Plackett-Burman (P-B) in Minitab 17, 3 significant effects (C content, N content and NaCl content) on amylase enzyme activity were screened out. According to the P-B experiment results and analysis of response surface methodology in Design Expert, the data showed that C content 7.5 %, N content 4.0 %, NaCl content 0.5%, and the maximum amylase enzyme activity was up to 276.14 U/mL under this condition. Fermentation experiment in 5 L fermenter results showed that amylase enzyme activity was up to 296 U/mL after 80-116 h fermentation using the optimal conditions.

amylase; Monascus purpureus; response surface methodology; fermentation conditions; culture and formulation; optimization

Q815

A

1006-060X（2017）04-0005-05

10.16498/j.cnki.hnnykx.2017.004.002

2017-02-13

国家自然科学基金（NO. 31570013；NO. 31270061）

许楚旋（1996-），女，浙江东阳市人，本科生，专业：应用微生物。

蒋冬花