安彦玲，周立飞，莫中福，马靖茹，李慧娜

(河北省石家庄市第六医院妇产科，河北 石家庄 050051)

·论 著·

Caspase-3、Bcl-2、Bax和p53与辅助生殖早孕期流产的相关研究

安彦玲，周立飞，莫中福，马靖茹，李慧娜

(河北省石家庄市第六医院妇产科，河北 石家庄 050051)

目的研究Caspase-3、Bcl-2、Bax和p53基因与辅助生殖早孕期流产的相关性。方法选择辅助生殖早孕期流产者40例为试验组，正常妊娠早孕人工流产者40例为对照组。收集清宫术后2组新鲜绒毛组织和蜕膜组织，采用缺口末端标记法检测绒毛组织和蜕膜细胞的凋亡指数，采用免疫组织化学法检测2组Caspase-3、Bcl-2、Bax和p53蛋白在胎儿绒毛组织和蜕膜组织中的表达，计算表达面积百分比。结果试验组蜕膜组织和绒毛组织的细胞凋亡指数均高于对照组(P<0.05)。试验组Caspase-3、Bax和p53蛋白表达百分比均显著高于对照组(P<0.05)；试验组绒毛组织细胞Bcl-2蛋白表达面积百分比低于对照组，蜕膜组织细胞Bcl-2蛋白表达面积百分比显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。结论Caspase-3、Bcl-2、Bax和p53蛋白表达失调可能与辅助生育早孕期流产有关。

生殖技术，辅助；早孕期流产；细胞凋亡

早孕期流产是一种比较常见的现象，其发病原因较多，包括内分泌、遗传疾病、免疫性疾病等因素，还有60%左右原因不明。近年来，随着辅助生育的开展，早孕期流产的问题更为突出[1-2]。已有报道发现，细胞凋亡在胚胎着床、胎盘的发育及胎儿的生长发育过程中具有重要的作用[3]。而流产其实就是一个细胞凋亡的过程。本研究拟通过检测胎儿绒毛和蜕膜组织细胞的凋亡指数及Caspase-3、Bcl-2、Bax和p53蛋白的表达，探讨早孕期流产的相关机制，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2014年1月—2015年6月在本院门诊就诊的辅助生殖早孕期流产者40例为试验组，入选标准：①卵巢功能正常，无生殖器官畸形和子宫疾病；②进入体外受精-胚胎移植周期的原因只是因为输卵管问题；③进入检测者按照标准长方案(促性腺激素释放激素激动剂重组卵泡刺激素)；④排除免疫性遗传性疾病及染色体异常者。试验组年龄21～32岁，平均(25.01±3.27)岁，体质量指数22.04±3.19，胎龄(59.94±8.63) d。另选择在本院门诊就诊的正常妊娠早孕且进行人工吸宫流产者40例为对照组，入选标准：身体健康，未服用任何相关药物，自愿实施人工流产者。对照组年龄21～31岁，平均(25.34±3.26)岁，体质量指数21.67±3.15，胎龄(57.85±7.52) d。2组年龄、体质量指数、胎龄差异均无统计学意义(P>0.05),具有可比性。

本研究征得医院医学伦理委员会批准。

1.2 标本采集 收集清宫术后2组新鲜绒毛组织和蜕膜组织，用10%福尔马林固定，乙醇脱水，石蜡包埋，制作成4 mm切片，以备试验用。

1.3 细胞凋亡指数检测 试剂盒购自福建迈新生物技术有限公司，采用缺口末端标记法(TUNEL法)测定绒毛组织和蜕膜组织的细胞凋亡情况，设阳性和阴性对照，阳性细胞也就是凋亡细胞(为在光学显微镜下细胞核有棕黄色颗粒者)，每张切片找3个视野，观测100个细胞并计算凋亡指数。

1.4 免疫组织化学检测 检测Caspase-3、Bcl-2、Bax和p53相关一抗、二抗试剂盒均购自武汉博士德生物技术有限公司，采用SP法检测蜕膜组织和绒毛组织中各蛋白的表达。设置阳性和阴性对照。Bcl-2、Bax表达阳性为胞浆棕黄色，p53、Caspase-3表达阳性为细胞核棕黄色。每张切片3个视野，计数100个细胞中阳性细胞数，计算阳性细胞比率；阳性细胞数<10%为阴性，10%～25%为弱阳性，>25%～50%为阳性，>50%为强阳性。

1.5 统计学方法 应用SPSS 20.0统计软件进行数据处理，计量资料比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 2组细胞凋亡指数比较 试验组蜕膜组织和绒毛组织的细胞凋亡指数均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.2 2组绒毛组织和蜕膜组织免疫组织化学结果 试验组绒毛组织和蜕膜组织细胞的Caspase-3蛋白、Bax蛋白、p53蛋白表达面积百分比均显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；试验组绒毛组织细胞的Bcl-2蛋白表达面积百分比显著低于对照组，而蜕膜组织显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表1 2组细胞凋亡指数比较

表2 2组Caspase-3、Bcl-2、Bax和p53蛋白在胎儿绒毛及蜕膜组织中表达比较 ，阳性面积百分比(%)]

3 讨 论

近年来，随着医学研究的快速发展，人们对细胞凋亡在妊娠中的作用日益重视。研究表明，在妊娠胎儿的发育过程中，一些关键蛋白因子维持在一定的水平对细胞凋亡与增殖平衡状态具有重要的作用；外界不良因素的刺激可打破这种平衡，致使细胞发生异常凋亡，有可能导致胎儿发育不良甚至流产；绒毛滋养细胞在早期胎盘发育过程中通过增殖和侵入母体细胞从而获得胎儿发育和增殖过程所需的各种营养物质，这个过程中时刻伴随着细胞的增殖和凋亡[4]。有研究表明，在胎盘形成过程中，胎盘滋养细胞的增殖和凋亡是胎儿生长发育的重要调节机制，其获得母体营养物质的能力主要依靠其增殖和凋亡功能[5]。

凋亡是多因素、多阶段和多基因严格控制的过程，受多因素的调控影响。半胱氨酸蛋白酶(Caspase)家族就是在细胞凋亡中发挥重要作用的水解酶。研究表明，妊娠早期就有滋养细胞正常的细胞凋亡现象，当出现不良外界因素的时候，滋养层细胞就会发生过度凋亡现象，打破了绒毛正常凋亡和生殖的平衡状态，导致病理性妊娠的发生[6]。本研究结果显示，试验组绒毛组织和蜕膜组织细胞凋亡指数均明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。进一步证实孕早期流产与凋亡有关。Caspase家族中目前唯一在胎盘组织表达的是Caspase-3，是一种细胞凋亡关键效应酶,它处在传导通路的下游，是诱导细胞凋亡的关键酶，Caspase-3一旦被激活，细胞凋亡必将发生，且不可逆转。本研究结果表明，试验组绒毛组织和蜕膜组织Caspase-3表达面积百分比明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。这与董枫等[7]、Panzan等[8]的研究结果一致。因此，认为Caspase-3基因高表达有可能是导致流产的重要因素，Caspase-3在组织细胞中的高表达很可能启动线粒体/细胞色素C及Fas介导的凋亡途径，引起滋养层细胞凋亡增加，而绒毛细胞的大量凋亡势必影响其正常的生理功能，绒毛生长受到影响，阻碍了孕卵的生长和发育，继而引起流产。

Bcl-2蛋白主要分布在人早孕的滋养层细胞和蜕膜细胞中。已有研究表明，Bcl-2家族在细胞凋亡中起到关键性作用，细胞凋亡调控与Bcl-2和Bax蛋白水平的高低密切相关，Bax增高可促进凋亡，Bcl-2增高可抑制细胞凋亡[9]。细胞受到外界不良因素的刺激后，在早孕过程中细胞凋亡的发生由Bcl-2/Bax比率所决定，一旦比值发生变化，Bcl-2和Bax蛋白就会形成Bcl-2/Bax同源二聚体，该二聚体使细胞内线粒体功能发生改变，通过一系列转导有可能导致大量细胞凋亡。所以，Bcl-2和Bax在早孕期胎儿正常发育过程中保持一定比率共同调节胎儿发育，使得细胞的增殖与凋亡处在一个平衡体系中，这样有利于胎儿的正常生长发育。如果受到外界不良因素的影响，就会打破了这一平衡，影响到妊娠结局。池永斌等[10]研究表明，复发性流产者蜕膜组织的NK细胞受体免疫球蛋白样受体2DL4、免疫球蛋白样转录物2、免疫球蛋白样转录物4表达下调就影响孕期蜕膜化和免疫细胞活化变化，引起流产。梁彤等[11]研究表明Bcl-2在妊娠期糖尿病、妊娠期糖耐量组胎盘绒毛细胞中表达少于正常组，Bax、Fas表达量低于正常组，差异有统计学意义(P<0.01)。说明Bcl-2、Bax、Fas在胎盘中的异常表达导致胎盘细胞过度凋亡，从而导致不良妊娠结局。Qi等[12]报道，复发性流产者的滋养层细胞中能检测到大量的凋亡细胞。贺子秋等[13]实验结果表明外界因素致妊娠鼠流产中绒毛滋养层细胞凋亡较正常鼠高。郭冬瑾等[14]报道，在绒毛组织细胞凋亡指数试验中，自然流产组明显高于对照组(P<0.05)，绒毛组织细胞中Bcl-2阳性率下降，Bax阳性率增高，其比值升高，与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.01)。本研究结果表明，试验组绒毛组织Bcl-2表达百分比低于对照组，Bax表达百分比显著高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)；试验组蜕膜组织Bcl-2蛋白表达百分比显著高于对照组，Bax蛋白表达量也高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。Bcl-2与Bax调节细胞凋亡的机制可能通过以下方面实现：①Bcl-2家族蛋白通过精确改变线粒体膜的通透性来调节促凋亡因子的释放，从而促进细胞凋亡；②Bcl-2家族蛋白通过诱导线粒体使其孔道开放，与Bax形成同源二聚体来降低线粒体外面的稳定性，促进细胞色素C的释放，激活Caspase-9等，进一步激活Caspase-3产生级联反应，从而导致大量细胞凋亡[4]。

p53蛋白作为转录因子，通过调节多个基因表达来维持细胞的完整性，同时具有诱导细胞分化和细胞凋亡的作用[15]。有研究表明，p53蛋白参与了细胞凋亡发生的机制，p53作为调节基因，当p53与Bax的结合位点结合以后就可以调控Bcl-2、Bax的表达，从而促进细胞凋亡[16]。本研究结果表明，试验组绒毛和蜕膜组织的p53蛋白表达百分比高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。p53与Bax在自然流产中绒毛和蜕膜组织表达的一致性，说明p53参与了Bcl-2/Bax诱导的细胞凋亡，从而导致早孕流产的发生。p53作为肿瘤抑制因子，在DNA损伤诱导细胞凋亡中发挥着极其重要的作用。5氟尿嘧啶处理人结肠癌细胞后p53表达升高，激活Bcl-2相关蛋白，最终导致凋亡发生;另外，博来霉素通过诱导神经元细胞的DNA损伤，进而激活p53依赖途径的细胞凋亡[17]。Bcl-2蛋白能够编码Bid,而p53能够通过Bid的表达上调，调节下游靶基因参与p53介导的细胞凋亡过程，p53还可以通过Bax的活化促进Bax蛋白插入到线粒体膜中，从而使线粒体的通透性增加，导致细胞凋亡[18]。总之，p53是已经研究证实了的肿瘤抑制基因，其在控制细胞周期、细胞凋亡及肿瘤的发生发展过程中起着非常大的作用，其决定性的机制有待于进一步研究。

综上所述，Caspase-3、Bcl-2、Bax和p53蛋白表达失调可能与辅助生殖早孕期流产有关。

[1] Wang JM,Gu Y,Zhang Y,et al. Deep-sequencing identification of differentially expressed miRNAs in decidua and villus of recurrent miscarriage patients[J]. Arch Gynecol Obstet，2016;293(5):1125-1135.

[2] Mohammad Sevedhassani S,Houshmand M,Mehdi Kalantar S,et al. BAX pro-apoptotic gene alterations in repeated pregnancy loss[J]. Arch Med Sci,2011,7(1):117-122.

[3] 马亦良，黄娟，白军.胎盘细胞凋亡与早产流产关系研究[J].延安大学学报：医学科学版,2014,12(1):22-25.

[4] 董颖，徐明娟.Bax/Bcl-2基因与细胞凋亡在母-胎界面表达及与病理妊娠的关系[J].生殖与避孕，2011,31(5):319-322.

[5] 罗锦花，齐荣义，田亚平.妊娠过程中凋亡级联的作用和调节[J].国际妇产科学杂志，2013,40(3):198-202.

[6] 唐莉，宿凌云，师义，等.Stathmin在早期自然流产组织中的表达[J].中国现代医学杂志,2015,25(8)：25-28.

[7] 董枫，候灵彤.Caspase-3和PLGF在早期胚胎停止发育患者绒毛和蜕膜组织中的表达[J].中国妇幼保健，2011,26(27)：4235-4237.

[8] Panzan MQ,Mattar R,Maqanhin CC,et al. Evaluation of Fas and Caspase-3 in the endometrail tissue of patients with idiopathic infertility and recurrent pregnancy loss[J]. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol,2013,167(1):47-52.

[9] 李国慧,闫红,黄晶,等.苦参碱调节Caspase-3、Smac及XIAP蛋白表达对肿瘤细胞凋亡的诱导作用[J].河北医科大学学报，2015,36(7)：800-802，806.

[10] 池永斌，许玲娣，姚芳娟，等.复发性流产患者蜕膜组织NK细胞受体的表达[J].现代免疫学，2014,34(5)：391-396.

[11] 梁彤，康佳丽，陈茜.Bcl-2、Bax、Fas在妊娠期糖尿病胎盘绒毛细胞中表达及意义[J].中外医疗，2010,29(34):21-22.

[12] Qi X,Lei M,Qin L,et al. Endogenous TWEAK is critical for regulating the function of mouse uterine natural killer cells in an immunological model of pregnancy loss[J]. Immunology，2016，148(1):70-82.

[13] 贺子秋，刘岚，陶昱.自然流产绒毛与蜕膜组织中细胞凋亡的研究[J].同济大学学报：医学版，2010,31(3):38-40.

[14] 郭冬瑾，林秀玲，樊柳宜.30例自然流产患者绒毛滋养细胞凋亡及调控蛋白Bcl-2、Bax的表达研究[J].海南医学，2012,23(15)：1-3.

[15] 唐大伟，贾佳，刘永杰，等.Bcl-2、Bax和p53在ART早孕流产胎儿绒毛和蜕膜中的表达[J].宁夏医学杂志，2015,37(9)：836-838.

[16] Cinar O,Kara F,Can A. Potential role of decidual apoptosis in the pathogenesis of miscarriages[J].Gynecol Endocrinol,2012,28(5):382-385.

[17] 张潇芸，姜英，杨军,等.p53非依赖性信号通路在DNA损伤致细胞凋亡中的研究进展[J].浙江大学学报：医学版,2013,42(2):217-223.

[18] 师迎旭，苏秀兰.p53、PUMA、MCL-1对于凋亡途径的调控[J].医学综述，2014,20(11):1923-1926.

(本文编辑：赵丽洁)

2016-12-06；

2017-03-23

河北省医学科学研究重点课题(ZD20140386)

安彦玲(1970-)，女，河北行唐人，河北省石家庄市第六医院主治医师，医学学士，从事妇产科疾病诊治研究。

R339.2

B

1007-3205(2017)05-0610-04

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.05.028