谢利霞，赵飞宇，王 冕，杨春水，罗 阳

(1.广东省深圳市南山区人民医院临床药学室，广东 深圳 518052；2.广东省深圳市南山区人民医院神经内科，广东 深圳 518052；3.广东省深圳市南山区人民医院药剂科中药房，广东 深圳 518052)

·论 著·

黄芩素通过抑制mTOR通路激活自噬促进神经细胞过量表达的alpha-突触核蛋白清除

谢利霞1，赵飞宇1，王 冕1，杨春水2，罗 阳3

(1.广东省深圳市南山区人民医院临床药学室，广东 深圳 518052；2.广东省深圳市南山区人民医院神经内科，广东 深圳 518052；3.广东省深圳市南山区人民医院药剂科中药房，广东 深圳 518052)

目的探讨黄芩素对神经细胞自噬的激活作用及其机制，以及对帕金森病病理性蛋白alpha-突触核蛋白(α-synuclein，α-syn)的清除效果。并观察黄芩素对α-syn诱导线粒体损伤的保护作用。方法通过在PC12神经细胞中过表达α-syn建立帕金森病细胞模型。经不同浓度的黄芩素处理后，观察α-syn的降解情况，并检测细胞自噬的激活情况。检测细胞乳酸脱氢酶的释放情况，观察黄芩素对神经细胞的保护作用。结果黄芩素处理可以剂量依赖地降低α-syn的表达水平，同时激活细胞自噬标志蛋白LC3以及降低自噬底物p62的水平。免疫荧光显示黄芩素促进了自噬小体的形成。黄芩素能够抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mamamalian target of rapamycin，mTOR)的活性。黄芩素降低了α-syn过表达引起的神经细胞毒性，主要表现为降低了细胞乳酸脱氢酶的释放。结论黄芩素通过抑制mTOR通路激活自噬促进神经细胞过量聚集的α-syn清除。

帕金森病；黄芩素；自噬

自噬是中枢神经系统中胞质蛋白的主要降解途径之一。目前对自噬调控的研究主要关注哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mamamalian target of rapamycin，mTOR)信号通路。mTOR信号途径的调控与自噬的活性密切相关，如果从细胞外获得营养不足，自噬就会被诱导以维持三磷酸腺苷(adenosine-triphosphate，ATP)生成和生物合成所需要的代谢池。alpha-突触核蛋白(α-synuclein，α-syn)被认为是治疗帕金森病(Parkinson disease，PD)的靶目标。中草药在治疗PD中具有潜在作用。本研究旨在探讨黄芩素作为神经元细胞中的有效自噬诱导剂，通过抑制mTOR诱导自噬和促进α-syn在神经元细胞中的降解，拮抗α-syn对神经细胞的毒性损伤。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 试剂和抗体 黄芩素(Sigma公司，批号：465119)；山羊抗小鼠(Invitrogen公司，批号：62-6520)；山羊抗兔二抗(Invitrogen公司，批号：31460)； 抗β-肌动蛋白(Cell Signaling Technology公司，批号：4967)；抗-LC3(Cell Signaling Technology公司，批号：2775)；抗磷酸-mTOR(Cell Signaling Technology公司，批号：2971)；抗磷酸-p70S6K(Cell Signaling Technology公司，批号：9205)；抗磷酸-4EBP1抗体(Cell Signaling Technology公司，批号：2855)；抗-α-syn抗体(BD Transduction Laboratories公司，批号：610787)；乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase，LDH)测定试剂盒(罗氏公司，批号：11644793001)。

1.2 仪器 激光共聚焦显微镜 (Leica TCS SP8，Leica Microsystems)；酶标仪(Gemini XPS Microplate Reader, molecular devise)。

1.3 方法

1.3.1 细胞系和细胞培养 可诱导表达α-syn的PC12细胞在补充有10%FBS和5%马血清的DMEM中生长，并在37 ℃、5%CO2培养箱中孵育。诱导表达时在培养基中加入1 mg/L的四环素(doxycycline,DOX)孵育24 h。

1.3.2 免疫染色 用含3.7%多聚甲醛的PBS固定细胞，用抗LC3抗体和荧光偶联的二抗染色，并且用FluorSave试剂固定。最后应用激光共聚焦显微镜记录荧光。

1.3.3 LDH测定 使用LDH细胞毒性测定试剂盒(Roche)定量测量从损伤的细胞释放到培养基中的LDH。简言之，将2.5×105个细胞/孔接种在24孔板中，第2天加入DOX处理48 h，然后加入不同浓度的黄芩素继续培养24 h，收集培养基上清(100 μL)，并与相同体积的工作溶液在室温下混合30 min。通过应用分光光度计(BioRad)在490 nm测量LDH活性。

1.4 统计学方法 应用PRISM统计软件处理数据。计量资料比较选用单因素方差分析，组间比较选用Turkey法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 黄芩素促进α-syn的降解 在诱导表达α-syn的PC12神经细胞中测试黄芩素清除α-syn的能力。在加入DOX后，细胞内产生大量的α-syn。在加入不同浓度的黄芩素处理细胞24 h后，可以观察到剂量依赖的α-syn的降解，而内对照β-actin是一致的(图1)。

图1 黄芩素促进α-syn降解
Figure 1 Baicalein promotes α-syn degradation

2.2 黄芩素激活神经细胞自噬功能 PC12细胞经不同浓度的黄芩素处理24 h。收集细胞提取蛋白行免疫印迹检测，黄芩素可以剂量依赖地促进自噬底物p62的降解，并同时增加了自噬标志蛋白LC3-Ⅱ的形成(图2)。用免疫染色方法观察PC12细胞中自噬小体形成的情况，加入黄芩素处理后，在细胞中显著增加了自噬小体(LC3点状聚集)的形成(图3)。说明黄芩素可以激活自噬。

图2 黄芩素激活神经细胞自噬功能：黄芩素在PC12细胞中剂量依赖地增加LC3-Ⅱ的形成，促进p62的降解
Figure 2 Baicalein activates neuron autophagy: Baicalein increases the expression of LC3-Ⅱ and decreases the expression of p62 in PC12 cells

图3 黄芩素激活神经细胞自噬功能：黄芩素在PC12细胞中增加LC3点状聚集的形成
Figure 3 Baicalein activates neuron autophagy: Baicalein increases LC3 punctate aggregation

2.3 黄芩素抑制mTOR通路活性 对PC12细胞进行不同浓度的黄芩素处理24 h。收集细胞提取蛋白行免疫印迹检测，黄芩素可以剂量依赖地抑制mTOR信号转导通路的活性，具体表现为对磷酸化mTOR以及对mTOR激酶下游底物(磷酸化P70S6K和磷酸化4EBP1)的抑制作用(图4)。说明黄芩素可以抑制mTOR通路活性，从而激活自噬。

2.4 黄芩素降低α-syn过表达引起的细胞毒性 α-syn过表达可以引起神经细胞毒性损伤，而自噬是促进α-syn降解、修复神经细胞损伤的保护机制。进行LDH释放实验。LDH存在于胞浆中，在细胞损伤的过程中会释放到培养基上清，因此其释放量是神经细胞损伤的指标之一。在过表达α-syn 48 h后，PC12细胞释放LDH量显著增加，而在同时加入黄芩素处理后，PC12细胞释放的LDH量呈剂量依赖的降低(图5)。说明黄芩素通过诱导自噬可以修复α-syn过表达引起的细胞毒性。

图4 黄芩素抑制mTOR通路活性
Figure 4 Baicalein inhibits mTOR signal pathway

图5 黄芩素降低α-syn过表达引起的细胞毒性
Figure 5 Baicalein decreases the cell toxicity induced by alpha-synuclein overexpression

3 讨 论

神经系统退行性疾病包括阿尔茨海默病、PD、亨廷顿舞蹈病、运动神经元疾病等都具有共同的特征：大脑受影响区域中蛋白质的积累异常[1]。α-syn是Lewy体的主要成分，其是存在于PD患者脑的多巴胺能神经元中的细胞内包涵体[2]，与早期PD相关的α-syn中的突变可以导致加速的α-syn原纤维形成[3]。因此，α-syn被认为是治疗PD的靶标。

中枢神经系统中胞质蛋白的主要降解系统是泛素-蛋白酶体系统和自噬途径[4]。自噬是一种用于降解和回收长寿蛋白的“自食”细胞基质和细胞器，以保持细胞内稳态的机制[5-7]。已经确定的是，α-syn聚集体以及其他易聚集的蛋白质包括tau和突变体huntingtin，在很大程度上依赖于巨自噬清除，因为它们不能通过狭窄的核心蛋白酶体降解[6]。通过用化学自噬诱导剂雷帕霉素治疗抑制神经变性启发研究人员发现促进神经元自噬的化合物[7]。最近在酵母和哺乳动物细胞中筛选这样的分子已经鉴定了激活自噬的小分子。已经显示这些化合物能诱导自噬和清除聚集倾向性蛋白如哺乳动物细胞中的突变体亨廷顿蛋白和α-syn[8]。

目前对自噬调控的研究主要关注mTOR依赖性和非依赖性的调节途径。mTOR是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，能够调节细胞新陈代谢并改善细胞在不同环境下的生长状态[9]。mTOR信号途径的调控与自噬的活性以及细胞外的营养状况密切相关，如果从细胞外获得的营养不足，那么自噬就会被诱导以维持ATP生成和生物合成所需要的代谢池[10]。越来越多的证据表明中草药可能是具有治疗神经退行性疾病潜在的神经保护剂的良好来源[11]。黄芩素是从中草药黄芩中提取的主要生物活性化合物，已知是一种有效的抗氧化剂和自由基清除剂，同时还是12/15-脂氧合酶抑制剂和黄嘌呤氧化酶抑制剂。黄芩素还显示出显著的抗炎、抗癌、和铁螯合活性[12-14]。

本研究采用免疫染色方法观察PC12细胞中自噬小体形成的情况，发现加入黄芩素处理后，在细胞中显著增加了自噬小体(LC3点状聚集)的形成。定位于前自噬体和自噬体膜的LC3-Ⅱ，是目前广泛认可的自噬体标志物。LC3-Ⅱ含量的多少在某种程度上反映了细胞自噬的活性，与自噬体的数量密切相关。因此，自噬的发生和激活程度可通过检测LC3-Ⅱ水平来确定。结果表明黄芩素可以激活自噬。本研究证实黄芩素能够在神经细胞中诱导自噬，并促进α-syn在神经元细胞清除。中枢神经系统中的自噬与非神经元细胞中的自噬调节方式有异，自噬活性在原代皮层神经元中是很高的，并且自噬体在健康的脑中快速清除。神经元中自噬的诱导比非神经元细胞中的自噬更困难[13]。经典的自噬诱导方式——饥饿不能有效地在大脑皮质诱导自噬，因此特异的神经细胞自噬激动剂有较好的治疗应用前景。自噬已经显示出作为细胞保护机制的功能，并且在脑衰老和神经变性中极为关键[14]。本研究揭示黄芩素在神经细胞系中可诱导自噬，表明黄芩素具有较好的神经药理活性。

黄芩素是从中草药黄芩中分离的黄酮，其在临床上用于治疗与神经变性疾病(包括PD)相关的症状。近年研究表明，自噬蛋白降解通路通过清除相关异常蛋白，降低这些聚集体的毒性，由此减慢PD疾病进程，已成为新的治疗靶点。研究表明α-syn与PD的病理生理机制有着密切的关系[15]。作为Lewy小体的重要纤维组成部分，α-syn既可见于散发的PD患者，又可见于α-syn基因突变的PD患者，而α-syn的自噬降解受损是PD中的神经变性的重要机制。研究发现黄芩素在PD等神经系统退行性疾病的临床症状改善和神经保护方面也有一定的效果[14]。

本研究结果表明，黄芩素在神经细胞中诱导自噬的能力，尽管不确定黄芩素的促自噬作用是否是中药黄芩治疗作用的药理活性，然而诱导自噬治疗神经退行性疾病似乎是一个较有前景的策略，因为该降解过程在多种神经退行性疾病模型中显示出的细胞保护作用。自噬诱导剂在神经变性疾病的哺乳动物模型中的活性尚未被彻底探究[16]。在今后的研究中，过表达α-syn的转基因小鼠将用于测试黄芩素的神经保护作用。黄芩素或其衍生物对神经退行性疾病的治疗价值尚未确定。仍然需要确认在脑中具有黄芩素的治疗浓度是可以实现的；黄芩素刺激自噬可以逆转病理过程和缓解症状。此外，在设计基于增强自噬的治疗时应谨慎，因为自噬的过度刺激也可能是有害的。

综上所述，黄芩素作为神经元细胞中的有效自噬诱导剂，能通过抑制mTOR途径诱导神经元细胞自噬和促进α-syn在神经元细胞中的降解，并拮抗α-syn对神经细胞的毒性损伤。

[1] Taylor JP，Hardy J，Fischbeck KH. Toxic proteins in neurodegenerative disease[J]. Science，2002，296(5575)：1991-1995.

[2] Spillantini MG，Crowther RA，Jakes R，et al. alpha-Synuclein in filamentous inclusions of Lewy bodies from Parkinson's disease and dementia with lewy bodies[J]. Proc Natl Acad Sci U S A，1998，95(11)：6469-6473.

[3] Conway KA，Harper JD，Lansbury PT. Accelerated in vitro fibril formation by a mutant alpha-synuclein linked to early-onset Parkinson disease[J]. Nat Med，1998，4(11)：1318-1320.

[4] Tooze SA，Schiavo G. Liaisons dangereuses： autophagy，neuronal survival and neurodegeneration[J]. Curr Opin Neurobiol，2008，18(5)：504-515.

[5] Mizushima N，Levine B，Cuervo AM，et al. Autophagy fights disease through cellular self-digestion[J]. Nature，2008，451(7182)：1069-1075.

[6] Tyedmers J，Mogk A，Bukau B. Cellular strategies for controlling protein aggregation[J]. Nat Rev Mol Cell Biol，2010，11(11)：777-788.

[7] 刘娜，董晓莉，叶俊丽，等.细胞自噬诱导剂雷帕霉素对小鼠小胶质细胞线粒体ROS表达及炎性细胞因子分泌水平的影响[J].山东医药，2016，56(27)：33-35.

[8] Du TT，Wang L，Duan CL，et al. GBA deficiency promotes SNCA/α-synuclein accumulation through autophagic inhibition by inactivated PPP2A[J]. Autophagy，2015，11(10)：1803-1820.

[9] 张国禄，程世翔，徐忠伟，等.RIPK3过表达对mTOR及其相关基因转录的调控作用[J].河北医科大学学报，2016，37(4)：377-381.

[10] 周生奎，程言博，耿德勤.神经细胞自噬与帕金森病的研究进展[J].中华行为医学与脑科学杂志，2010，19(7)：666-668.

[11] 刘宏帅，石海莲，高雅婵，等.神经炎症与神经退行性疾病的关系及中药调控作用研究进展[J].上海中医药大学学报，2016，30(5)：82-89.

[12] 于昕，何国荣，杜冠华.黄芩素对帕金森病的神经保护作用[J].中国中药杂志，2012，37(4)：421-425.

[13] Tsvetkov AS，Miller J，Arrasate M，et al. A small-molecule scaffold induces autophagy in primary neurons and protects against toxicity in a Huntington disease model[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2010，107(39)：16982-16987.

[14] Rubinsztein DC，Gestwicki JE，Murphy LO，et al. Potential therapeutic applications of autophagy[J]. Nat Rev Drug Discov，2007，6(4)：304-312.

[15] 宋香全，康云霄，李双成.α-synuclein表达与相关神经系统疾病的关系[J].河北医科大学学报，2010，31(3)：364-367.

[16] Choi AM，Ryter SW，Levine B. Autophagy in human health and disease[J]. N Engl J Med，2013，368(7)：651-662.

(本文编辑：赵丽洁)

Baicalein activates autophagy induced by mTOR pathway and degrades the overexpression of alpha-synuclein

XIE Li-xia1， ZHAO Fei-yu1， WANG Mian1， YANG Chun-shui2， LUO Yang3

(1.DepartmentofClinicalPharmacy，ShenzhenNanshanPeople′sHospital，GuangdongProvince，Shenzhen518052，China； 2.DepartmentofNeurology，ShenzhenNanshanPeople′sHospital，GuangdongProvince，Shenzhen518052，China； 3.DepartmentofTCMpharmacy，ShenzhenNanshanPeople′sHospital，GuangdongProvince，Shenzhen518052，China)

Objective To investigate the effects and mechanisms of Baicalein on autophage activation and the removal of abnormal alpha-synuclein aggragation in Parkinson disease. And to observe the protective effect of baicalein on mitochondrial damage induced by alpha-synuclein. Methods The overexpression of alpha-synuclein model was established in PC12 cells. Then the cells were treated by different concentrations of Baicalein. The degradation of alpha-synuclein was detected by confocal laser scanning microscopy. Finally, the cell lactate dehydrogenase release was examined by use of LDH kit. Results Baicalein can dose-dependently reduce the expression level of alpha-synuclein, activate autophagy markers LC3 and decrease the level of autophagy substrate p62. Immunofluorescence and western blotting show that Baicalein can inhibit mamamalian target of rapamycin(mTOR)to promote the formation of autophagosome. In addition, the Baicalein can decrease alpha-synuclein overexpression of nerve cell toxicity by reducing the release of cell lactate dehydrogenase. Conclusion Autophagy activation induced by mTOR signal transduction pathway can lead to the removal of abnormal aggregation alpha-synuclein in neurons.

Parkinson disease； Baicalein； autophagy

2017-03-15；

2017-04-10

广东省中医药局建设中医药强省科研课题(20141250)；深圳市南山区卫生科技立项(医疗卫生类)(2013026)

谢利霞(1977-)，女，山西大同人，广东省深圳市南山区人民医院副主任药师，药理学博士，从事临床药学、医院药学、药理学研究。

R742.5

A

1007-3205(2017)05-0585-05

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.05.020